高效液相色譜法測(cè)定苦檀子中β-谷甾醇的含量
——基于正交試驗(yàn)優(yōu)化的皂化反應(yīng)法△

孫倩男 王棟 周雪梅 張建平（內(nèi)蒙古自治區(qū)藥品檢驗(yàn)研究院-中蒙藥標(biāo)準(zhǔn)研究實(shí)驗(yàn)室呼和浩特010020）

苦檀子，豆科植物厚果崖豆藤M(fèi)illettia pachycarpa Benth.的干燥成熟種子，植物多分布于福建、廣西、四川、貴州、云南等地，具有攻毒止痛、消積殺蟲(chóng)之功效，常用于疥癬瘡癩、痧氣腹痛、小兒疳積。苦檀子中主要含有魚(yú)藤酮和擬魚(yú)藤酮，除此之外還含有β-谷甾醇（Ⅰ）、齊墩果酸（Ⅱ）、水黃皮素（Ⅲ）、厚果雞血藤甲素（Ⅳ）等成分[1]。β-谷甾醇是植物甾醇類成分之一，存在于某些植物或種子中，具有降血脂、抗癌、抗炎癥等作用，可作為苦檀子質(zhì)量控制的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)用HPLC法測(cè)定苦檀子中β-谷甾醇含量，由于直接使用溶劑提取β-谷甾醇干擾物質(zhì)較多，利用β-谷甾醇不發(fā)生皂化反應(yīng)這一特點(diǎn)，通過(guò)皂化反應(yīng)還原大部分干擾物質(zhì)使得β-谷甾醇可以準(zhǔn)確定量。同時(shí)通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)對(duì)提取方法進(jìn)行優(yōu)化，使該法操作簡(jiǎn)便，定量準(zhǔn)確。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器：苦檀子（購(gòu)于安國(guó)云天）；β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度：97%）（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110851-201608）；氫氧化鉀（天津南開(kāi)大學(xué)分校特種試劑實(shí)驗(yàn)廠，批號(hào)：20020410）；乙醇（AR）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20180223）；甲醇（HPLC）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：WXBC6196V）；乙腈（HPLC）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：WXBC6307V）。遠(yuǎn)紅外鼓風(fēng)干燥箱（天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；低速大容量離心機(jī)（上海菲恰爾分析儀器有限公司）；島津LC-20A型高效液相色譜儀，配有紫外檢測(cè)器。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 HPLC測(cè)定 β-谷甾醇的條件：Apollo C18反相色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-乙腈（體積比 60∶40），檢測(cè)波長(zhǎng) 210 nm（0～30 min），柱溫 40 ℃；流速 1.2 mL·min-1，進(jìn)樣量 20 μL，以 50 μg·mL-1β-谷甾醇正己烷溶液進(jìn)行外標(biāo)法定量。

1.2.2 苦檀子中β-谷甾醇的提?。喝】嗵醋蛹?xì)粉2 g，加20 mL乙醇溶液和若干毫升50% KOH溶液，密封，劇烈振搖后在一定溫度下皂化若干小時(shí)[2]。半小時(shí)內(nèi)10 min振搖1次，之后每半小時(shí)振搖1次。趁熱加入10 mL水，用10 mL正己烷振搖提取1次，再加正己烷振搖提取2次，每次5 mL，合并正己烷液，定容至25 mL容量瓶中，過(guò)0.45 μm有機(jī)微孔濾膜后，進(jìn)行HPLC測(cè)定。

2 皂化法提取苦檀子中β-谷甾醇單因素實(shí)驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化

苦檀子的特點(diǎn)是子葉占據(jù)種子的90%以上，含大量的油脂及糖類，測(cè)定β-谷甾醇干擾眾多，采用皂化反應(yīng)法將干擾物質(zhì)反應(yīng)除去。皂化反應(yīng)主要影響因素為溫度、時(shí)間、皂化液濃度，本研究以單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)進(jìn)行條件優(yōu)化，得到最佳提取條件。

2.1 皂化法提取苦檀子中β-谷甾醇單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 皂化液加入體積對(duì)β-谷甾醇提取量的影響：根據(jù)“1.2.2”在皂化溫度為80℃，皂化時(shí)間為2 h時(shí)考察皂化液加入體積對(duì)β-谷甾醇提取量的影響。

2.1.2 皂化時(shí)間對(duì)β-谷甾醇提取量的影響：根據(jù)“1.2.2”在皂化溫度為80℃，皂化液加入體積為10 mL時(shí)考察皂化時(shí)間對(duì)β-谷甾醇提取量的影響。

2.1.3 皂化溫度對(duì)β-谷甾醇提取量的影響：根據(jù)“1.2.2”在皂化時(shí)間為2 h，皂化液加入體積為10 mL時(shí)考察皂化溫度對(duì)β-谷甾醇提取量的影響。

2.2 苦檀子中β-谷甾醇提取工藝正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化：選用L16（4，5）正交表對(duì)苦檀子中β-谷甾醇提取方法進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，正交實(shí)驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素及水平Table 1 Orthogonal test factors and levels

3 方法學(xué)考察

3.1 線性：取 β-谷甾醇對(duì)照品溶液（50 μg·mL-1），分別進(jìn)樣 1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、20 μL，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。β-谷甾醇對(duì)照品溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程為Y=177784X+692.77，r=0.9999，表明β-谷甾醇對(duì)照品進(jìn)樣量在0.05～1 μg間線性關(guān)系良好。

3.2 精密度實(shí)驗(yàn)：取β-谷甾醇對(duì)照品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣20 μL，記錄峰面積。計(jì)算RSD值即相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.51%，表明儀器誤差小，精密度高。

3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)：取供試品粉末5份，每份2.000 g，精密稱定。按照最優(yōu)提取方法制備5份供試品溶液，按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定β-谷甾醇峰面積，計(jì)算質(zhì)量分?jǐn)?shù)。計(jì)算RSD為1.10%，說(shuō)明重復(fù)性好，供試品溶液制備方法可行。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取按照最優(yōu)提取方法制備的供試品試樣液，室溫放置，分別于 0 h、2 h、6 h、12 h 和 24 h 按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，測(cè)定樣品中β-谷甾醇含量的RSD值為1.70%，表明供試品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.5 回收率實(shí)驗(yàn)：按照最優(yōu)提取方法，供試品樣中分別加入0.5 mL、0.68 mL、0.82 mL 50 μg/mL的β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品溶液，正己烷定容至5 mL。按“1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算苦檀子樣品中的β-谷甾醇的回收率。平均回收率為118.8%，RSD為0.94%。

4 結(jié)果與討論

4.1 HPLC測(cè)定苦檀子中β-谷甾醇含量：分別對(duì)β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品、苦檀子皂化后收集的正己烷液以及乙醇溶液直接超聲提取的苦檀子樣品進(jìn)行HPLC測(cè)定，結(jié)果如圖1所示。

由圖1可知，苦檀子皂化后收集的正己烷液中β-谷甾醇（B）的保留時(shí)間（min）與β-谷甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（A）一致，峰形對(duì)稱，分離效果良好。而未經(jīng)皂化反應(yīng)直接用乙醇超聲處理得到的苦檀子樣品（C），由于干擾物質(zhì)與β-谷甾醇保留時(shí)間相近，β-谷甾醇未能得到良好的分離。由此可見(jiàn)，利用皂化反應(yīng)的原理，大部分干擾物質(zhì)經(jīng)皂化轉(zhuǎn)化成醇和羧酸鹽等水溶性物質(zhì)，經(jīng)過(guò)水與正己烷的萃取使得干擾物質(zhì)與β-谷甾醇分離，實(shí)現(xiàn)了樣品的凈化。

4.2 皂化法提取苦檀子中β-谷甾醇單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化

4.2.1 皂化液加入體積對(duì)β-谷甾醇提取量的影響：根據(jù)“1.2.2”，考察皂化液加入體積對(duì)β-谷甾醇提取量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可知，隨著加入皂化液的體積逐漸增大，β-谷甾醇的提取量逐漸升高。當(dāng)加入的皂化液體積達(dá)到10 mL時(shí)，β-谷甾醇的提取量最大。繼續(xù)加入皂化液，β-谷甾醇的提取量降低并趨于平穩(wěn)。因此，選擇最佳加入皂化液體積為10 mL。

4.2.2 皂化時(shí)間對(duì)β-谷甾醇提取量的影響：根據(jù)“1.2.2”，考察皂化時(shí)間對(duì)β-谷甾醇提取量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，當(dāng)加入皂化液的體積為10 mL，皂化溫度為80℃時(shí)，隨著皂化時(shí)間的延長(zhǎng)，β-谷甾醇的提取量先升高；當(dāng)皂化時(shí)間為2 h時(shí)，β-谷甾醇的提取量最大；繼續(xù)延長(zhǎng)皂化時(shí)間，β-谷甾醇提取量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)并趨于平穩(wěn)。因此，選擇最佳皂化時(shí)間為2 h。

4.2.3 皂化溫度對(duì)β-谷甾醇提取量的影響：根據(jù)“1.2.2”，考察皂化溫度對(duì)β-谷甾醇提取量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

由圖4可知，隨著皂化溫度升高，β-谷甾醇的提取量先升高后降低；當(dāng)皂化溫度為80℃時(shí)，皂化效果最佳，β-谷甾醇的提取量最高。因此，選擇最佳皂化溫度為80℃。

4.2.4 苦檀子中β-谷甾醇提取工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化：選用L16（4，5）正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results

由表2可知，RA＞RB＞RC，即皂化液加入體積＞皂化時(shí)間＞皂化溫度。結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果優(yōu)選出最佳工藝組合為A4B2C2，即最佳提取工藝條件為皂化液加入體積10 mL，皂化時(shí)間2 h，皂化溫度80℃。

結(jié)合單因素實(shí)驗(yàn)與正交優(yōu)化的結(jié)果，皂化液加入體積對(duì)β-谷甾醇提取量的影響最大，可能是由于皂化液的量直接決定皂化反應(yīng)是否完全，從而最大程度除去樣品中的干擾物質(zhì)，使β-谷甾醇與其較好分離。而皂化時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使β-谷甾醇部分氧化分解進(jìn)而造成含量降低[3]，所以控制皂化時(shí)間可保證β-谷甾醇在獲得良好分離的基礎(chǔ)上不發(fā)生氧化分解，保證提取量不被影響。由于皂化反應(yīng)本身屬于放熱反應(yīng)，所以只需要反應(yīng)初期有一個(gè)適宜的溫度加快反應(yīng)，所以皂化溫度對(duì)于β-谷甾醇提取量的影響最低。

5 結(jié)論

通過(guò)考察加入皂化液體積、皂化溫度及皂化時(shí)間對(duì)高效液相色譜法測(cè)定苦檀子中β-谷甾醇提取量的影響，優(yōu)化得到的最佳提取工藝條件為：加入10 mL皂化液，皂化時(shí)間2 h，皂化溫度80℃。在最佳提取工藝條件下得到β-谷甾醇回收率為118.8%，RSD為0.94%，測(cè)得苦檀子中β-谷甾醇含量為0.020%。該方法操作簡(jiǎn)單，分離效果良好，結(jié)果準(zhǔn)確。