基于二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)的非標(biāo)記定量人腎透明細(xì)胞癌組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究

郭 佳 劉金華 楊照微 李 毅 何成彥*

1(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院，長(zhǎng)春 130033) 2(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院，長(zhǎng)春 130022)

1 引 言

腎癌起源于腎小管上皮細(xì)胞，是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]。目前，借助超聲、CT、MRI等醫(yī)學(xué)影像技術(shù)，可以對(duì)一部分腎癌進(jìn)行有效診斷，進(jìn)而給予相應(yīng)的治療[2]。然而，某些患者確診時(shí)，已經(jīng)處于腎癌晚期。由于晚期腎癌對(duì)化學(xué)療法或放射療法都不敏感，因而對(duì)其治療的有效手段非常有限[3]。對(duì)于晚期腎癌特異性的有效診療分子靶標(biāo)的認(rèn)知還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。隨著基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等高通量技術(shù)的發(fā)展[4～6]，對(duì)腎癌、特別是晚期腎癌進(jìn)行基因、蛋白水平的整體表征成為可能。目前，大多數(shù)利用高通量技術(shù)對(duì)腎癌的研究主要采用基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)手段，致力于評(píng)估已知的參與腎癌致癌作用的基因以及化學(xué)療法的毒性和療效方面[7～9]。蛋白質(zhì)是細(xì)胞和生物體功能的重要執(zhí)行者，蛋白質(zhì)組學(xué)已成為基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的重要補(bǔ)充技術(shù)手段[10,11]。因此，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究腎癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制有可能獲得與疾病密切相關(guān)的診療分子靶標(biāo)[12,13]。已有的腎癌蛋白質(zhì)組學(xué)的研究報(bào)道多采用各種腎癌的細(xì)胞系[14,15]，雖然這些永生化的細(xì)胞系來(lái)源于腎癌患者的手術(shù)切除組織、血清、以及尿液，但是為了適應(yīng)全新的體外環(huán)境，在馴化誘導(dǎo)過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)的某些基因蛋白質(zhì)表達(dá)會(huì)發(fā)生變化。因此，直接以腎癌組織樣本為研究對(duì)象，分析其蛋白質(zhì)整體表達(dá)輪廓，所得結(jié)果更能反映在腫瘤微環(huán)境中細(xì)胞內(nèi)真實(shí)的蛋白表達(dá)情況。

非標(biāo)記蛋白質(zhì)組分析技術(shù)是蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)中重要的分析策略之一[16～19]，具有樣本處理操作簡(jiǎn)單、實(shí)驗(yàn)成本低、不受研究樣本種類和規(guī)模等方面的限制等優(yōu)點(diǎn)，越來(lái)越多的被應(yīng)用在臨床大隊(duì)列樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)研究中。非標(biāo)記蛋白質(zhì)組分析技術(shù)主要基于實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的一級(jí)質(zhì)譜(MS1)和二級(jí)質(zhì)譜(MS2)數(shù)據(jù)，對(duì)其進(jìn)行特征提取、鑒定信息整合、定量分析，完成蛋白質(zhì)水平的相對(duì)定量分析。其中，基于MS1數(shù)據(jù)的定量方法主要依據(jù)MS1相關(guān)的肽段峰強(qiáng)度(MS1 peak intensity)、峰面積(Peak area)、液相色譜保留時(shí)間(Retention time)等特征信息進(jìn)行定量分析[20]。而基于MS2數(shù)據(jù)的定量方法則分為兩種: 一種依據(jù)每個(gè)蛋白鑒定得到的肽段所對(duì)應(yīng)譜圖的數(shù)量，對(duì)該蛋白質(zhì)在體系中的相對(duì)豐度進(jìn)行定量分析，也稱譜圖計(jì)數(shù)法(Spectral count)[21]; 另一種則依據(jù)每個(gè)蛋白鑒定得到的肽段所對(duì)應(yīng)MS2的離子強(qiáng)度總和，對(duì)該蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量分析，也稱MS2 TIC (Total ion current)法[22]。

本研究利用基于MS2數(shù)據(jù)的非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法，對(duì)晚期腎透明細(xì)胞癌和正常腎臟組織樣本進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析。采用譜圖計(jì)數(shù)和MS2 TIC兩種數(shù)據(jù)處理方法分別對(duì)采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并對(duì)兩種方法所得結(jié)果進(jìn)行比較。采用MS1數(shù)據(jù)對(duì)所得的定量分析結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。篩選出的差異蛋白可作為晚期腎透明細(xì)胞癌診治、預(yù)后判斷的候選標(biāo)志物，為尋找新的治療靶點(diǎn)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

Easy-nLC1000納升液相色譜系統(tǒng)、 Q Exactive質(zhì)譜儀和Varioskan酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo Scientific公司); Allegra TM X-22R離心機(jī)、 Optima L-100K超速離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司); 離心干燥機(jī)(德國(guó)Christ公司)。

BCA蛋白定量試劑盒、Pierce C18吸頭(100μL)(美國(guó)Thermo Scientific公司); 測(cè)序級(jí)TPCK修飾的胰蛋白酶(美國(guó)Promega公司); 碳酸氫銨、尿素、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、二硫蘇糖醇(DTT)、三氟乙酸(TFA)、碘乙酰胺(IAA)、甲酸、乙腈、苯甲基磺酰氟(PMSF)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司; 其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)MilliQ純水儀(美國(guó)Millipore公司)制備的超純水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 蛋白質(zhì)提取3例腎透明細(xì)胞癌組織樣本、3例來(lái)源于同一患者的腎臟正常組織樣本取自吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院就診并手術(shù)治療的晚期腎透明細(xì)胞癌患者。所有患者均知情同意，且在進(jìn)行根治性腎切除術(shù)之前未接受任何放療或化療。標(biāo)本離體后，置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中用磷酸鹽緩沖液沖洗、切碎，再放入液氮中研磨。然后使用含有8 mol/L尿素、 50 mmol/L Tris 和 50 mmol/L DTT、 1 mmol/L PMSF 的緩沖液提取蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)提取液經(jīng)100000 g離心1 h， 去除不溶解成分。使用BCA方法測(cè)定樣品蛋白質(zhì)濃度，并用蛋白提取緩沖液將所有樣品的蛋白質(zhì)濃度調(diào)整為一致。取等量的腎透明細(xì)胞癌樣品混合，作為腫瘤樣本(Tumor); 取等量的腎臟正常組織樣品混合，作為正常對(duì)照樣本(Normal)。所有樣品分裝后， 置于-80℃保存。

2.2.2 蛋白質(zhì)酶切處理蛋白質(zhì)樣品從冰箱中取出，室溫融化后，用100 mmol/L NH4HCO3稀釋， 使尿素濃度低于2 mol/L。酶切時(shí)，首先加入20 mmol/L DTT， 在56℃下還原1 h，在常溫避光條件下用50 mmol/L IAA烷基化30 min，然后按1∶50 (w/w)比例加入測(cè)序級(jí)胰酶，37℃酶切過(guò)夜。向酶切后的樣品中加入終濃度為1%的甲酸，終止酶解反應(yīng)。肽段混合物經(jīng)17000 g離心15 min, 去除不溶解成分，并用Pierce C18吸頭脫鹽。然后將純化的酶解肽段混合物離心干燥，于-80℃保存。

2.2.3 納升毛細(xì)管液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析將腫瘤樣品和正常組織樣品分別溶解在緩沖液A(水-乙腈-甲酸, 99∶1∶0.1，V/V)中，采用 Easy-nLC 1000納升液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行分離。每個(gè)樣品重復(fù)分析5次。 C18毛細(xì)管色譜柱(150 mm×0.075 mm， 3 μm)為實(shí)驗(yàn)室自制[23]。流動(dòng)相 B為乙腈-水-甲酸(99∶1∶0.1，V/V)，梯度洗脫: 0～10 min， 2% B; 10～75 min， 2%～40% B; 75～85 min，40%～95% B; 85～90 min，95% B。流速為300 nL/min。肽段洗脫后，采用 Q Exactive質(zhì)譜儀進(jìn)行分析。設(shè)定離子傳輸管的溫度為280℃，MS1的采集范圍為m/z700～2000，噴霧電壓為2.8 kV。 質(zhì)量分辨率設(shè)定為70 k(m/z200)，MS2的質(zhì)量分辨率設(shè)定為 17.5 k。自動(dòng)增益控制(AGC)值為 2×105，最大注入時(shí)間(Injection time)為 50 ms。每次全掃描后最多采集15個(gè)碎片圖譜，歸一化碰撞能量設(shè)為28% HCD。

2.2.4 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索將采集到的質(zhì)譜數(shù)據(jù)傳輸?shù)綌?shù)據(jù)處理工作站，使用Comet(2019.01版本)質(zhì)譜數(shù)據(jù)分析軟件[24]，在SwissProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索。檢索參數(shù): 物種為人(Homo sapiens); 蛋白酶為胰蛋白酶(Trypsin)，允許最多2個(gè)漏切位點(diǎn); 母離子允許最大誤差為15 ppm(10-6)， 子離子允許最大誤差為0.8 Da; 半胱氨酸(Cys)烷基化為固定修飾，蛋白質(zhì)N端(Protein N-term)乙?；约凹琢虬彼?Met)的氧化為可變修飾。蛋白質(zhì)假陽(yáng)性率(Protein FDR)控制在小于或等于1%。

2.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析從蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果中提取各個(gè)蛋白鑒定多肽對(duì)應(yīng)的MS2 TIC和譜圖數(shù)，將對(duì)應(yīng)同一蛋白質(zhì)的多肽的豐度數(shù)據(jù)(MS2 TIC和譜圖數(shù))分別相加，得到各個(gè)蛋白質(zhì)的MS2 TIC和譜圖數(shù)。分別依據(jù)每個(gè)蛋白質(zhì)的MS2 TIC和譜圖數(shù)評(píng)價(jià)其相對(duì)豐度， 并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。首先對(duì)所得結(jié)果進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換，然后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾，以確保在兩組數(shù)據(jù)中的至少一組中至少有兩個(gè)有效數(shù)據(jù)。使用edgeR軟件包[25]篩選差異表達(dá)蛋白質(zhì)(Differentially-expressed protein， DEP)。采用雙側(cè)T檢驗(yàn)，篩選FDR(False discovery rate)值<0.05并同時(shí)滿足倍數(shù)變化(Fold Change，F(xiàn)C)>2的蛋白。使用Skyline(20.1版本)軟件[26]提取MS1豐度信息，對(duì)基于MS2豐度信息的部分蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

3 結(jié)果與討論

差異蛋白質(zhì)組學(xué)的研究目的是發(fā)現(xiàn)在特定生理或病理?xiàng)l件下的蛋白質(zhì)的特定表達(dá)情況，也稱為定量蛋白質(zhì)組學(xué)。例如，通過(guò)比較正常和疾病狀況下，或者機(jī)體在各種化學(xué)和物理因素作用下，組織或細(xì)胞中蛋白質(zhì)表達(dá)狀態(tài)的差異，可以篩選出與特定疾病或外界因素相關(guān)的蛋白質(zhì)，有助于闡明疾病的致病機(jī)制以及機(jī)體對(duì)外界環(huán)境因素的反應(yīng)機(jī)制。質(zhì)譜技術(shù)是目前主流的蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析技術(shù)。常用的基于質(zhì)譜技術(shù)的定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法主要分為標(biāo)記(Label)[27]和非標(biāo)記(Label-free)[28]兩大類。其中，非標(biāo)記法蛋白質(zhì)定量技術(shù)是通過(guò)比較不同樣品中相應(yīng)肽段的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度，從而對(duì)肽段對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量分析。非標(biāo)記法的技術(shù)優(yōu)勢(shì)在于蛋白質(zhì)不需要進(jìn)行標(biāo)記，所需樣品總量少，不受樣品種類限制，可以實(shí)現(xiàn)大隊(duì)列臨床樣本分析，因此已成為越來(lái)越重要的蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析方法。目前常用的非標(biāo)記定量分析方法的原理是以MS1為基礎(chǔ)，計(jì)算每個(gè)肽段的信號(hào)強(qiáng)度在LC-MS色譜圖中的面積積分?；贛S2數(shù)據(jù)的蛋白質(zhì)組定量分析方法是以蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果為定量分析依據(jù), 其中，以譜圖計(jì)數(shù)法為主，發(fā)展比較早，已經(jīng)形成多種定量算法，而基于MS2 TIC定量分析方法則應(yīng)用較少。

3.1 樣本質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)一致性評(píng)價(jià)

圖1 腎透明細(xì)胞癌和正常腎組織蛋白鑒定質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)情況Fig.1 Comparison of intensity responses of mass spectrometric (MS) data of protein identification from replicates of both tumor and normal tissues

本研究以腎透明細(xì)胞癌組織為對(duì)象，分別用兩種基于MS2的定量分析方法對(duì)所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，并對(duì)定量分析結(jié)果進(jìn)行了比較。首先考察了各個(gè)分析樣本的質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)的總體情況。由于樣本的物種和組織類型是一致的，而且樣本的處理方法和質(zhì)譜分析方法也完全一致，因此以各個(gè)樣本的蛋白質(zhì)組鑒定結(jié)果為依據(jù)，將每個(gè)樣本中所有鑒定蛋白所對(duì)應(yīng)肽段的離子流強(qiáng)度分別相加后取對(duì)數(shù)，作為各個(gè)樣本的整體質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)值。如圖1所示，重復(fù)樣本之間的質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)一致，兩組樣本之間質(zhì)譜信號(hào)響應(yīng)也相近，說(shuō)明所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)可以進(jìn)行后續(xù)方法學(xué)的評(píng)估比較。

3.2 譜圖計(jì)數(shù)和MS2 TIC兩種數(shù)據(jù)分析方法的比較

從蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果中提取了各個(gè)樣本蛋白質(zhì)的特征參數(shù)，包括譜圖數(shù)和MS2 TIC。圖2顯示了所有樣本的蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果中譜圖數(shù)和MS2 TIC兩種數(shù)據(jù)的分布情況?？傮w而言，MS2 TIC的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(Relative standard deviation, RSD)比譜圖數(shù)的數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差略大: MS2 TIC的RSD中位值為36%，上限值達(dá)到72%; 而譜圖數(shù)數(shù)據(jù)的RSD中位值為32%，上限值為64%。由于MS2 TIC本質(zhì)上屬于質(zhì)譜儀采集的原始數(shù)據(jù)，能夠反映實(shí)際數(shù)據(jù)的多樣性和復(fù)雜性; 而譜圖數(shù)則是經(jīng)過(guò)搜庫(kù)、篩選等一系列的數(shù)據(jù)處理得到的結(jié)果數(shù)據(jù)，對(duì)原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)的多樣性和復(fù)雜性不十分“敏感”。這兩種數(shù)據(jù)本質(zhì)上的差別導(dǎo)致了其分布的不同，MS2 TIC比譜圖數(shù)數(shù)據(jù)分布更分散。

圖2 譜圖計(jì)數(shù)和MS2 TIC兩種數(shù)據(jù)的分布情況Fig.2 Distribution of the data from both spectral count and MS2 TIC of protein identification of all samplesTIC, total ion current.

圖3 相關(guān)性分析: 譜圖計(jì)數(shù)方法(A)和MS2 TIC方法(B)Fig.3 Correlation analysis: spectral count (A) and MS2 TIC (B)

進(jìn)一步考察了MS2 TIC和譜圖數(shù)兩種定量方法處理不同樣本的相關(guān)性。將所有分析樣本每?jī)蓚€(gè)分成一組，每組分別計(jì)算MS2 TIC和譜圖數(shù)與兩種蛋白質(zhì)豐度數(shù)據(jù)的相關(guān)性。其中，所有蛋白質(zhì)豐度數(shù)據(jù)均進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后，分別計(jì)算每組數(shù)據(jù)的皮爾森相關(guān)系數(shù)(Pearson correlation)及R2值。相關(guān)性分析顯示(圖3)，MS2 TIC方法(皮爾森相關(guān)系數(shù)0.9566，R2=0.9150)總體上略優(yōu)于譜圖計(jì)數(shù)法(皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.9131，R2=0.8140)。在高豐度蛋白區(qū)域，兩種方法差別不大; 而對(duì)于低豐度蛋白，MS2 TIC方法顯著優(yōu)于譜圖計(jì)數(shù)法。

3.3 譜圖計(jì)數(shù)和MS2 TIC兩種數(shù)據(jù)分析方法篩選差異蛋白

圖4 譜圖計(jì)數(shù)和MS2 TIC在人腎透明細(xì)胞癌組織中鑒定得到的差異表達(dá)蛋白(A)，包括46個(gè)蛋白上調(diào)和101個(gè)蛋白下調(diào)(FDR<0.05 and Fold Change> 2)(B)Fig.4 Identification of differentially expressed proteins (DEP)of human renal clear cell carcinoma using spectral count and MS2 TIC (A), 46 up-regulated proteins and 101 down-regulated proteins (FDR<0.05 and Fold Change> 2) (B)

分別使用兩種方法對(duì)所得蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，篩選出差異蛋白(圖4A)。其中，譜圖計(jì)數(shù)法篩選出120個(gè)差異蛋白質(zhì)，MS2 TIC法篩選出144個(gè)差異蛋白。兩種方法共篩選出147個(gè)差異蛋白，其中兩種方法重疊的部分有117個(gè)蛋白。由此可見(jiàn)，MS2 TIC方法篩選出大部分的差異蛋白(98.0%), 明顯多于譜圖計(jì)數(shù)法(81.6%)。在147個(gè)差異蛋白中(圖4B)，腫瘤組織上調(diào)蛋白有46個(gè)，包括膜聯(lián)蛋白 A4、層粘連蛋白α-4亞基、丙酮酸激酶、ATP-檸檬酸合成酶、組蛋白 H1.5和碳酸酐酶9等; 腫瘤組織下調(diào)蛋白有101個(gè)，包括電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白β亞基、3-酮脂?；鵆oA硫解酶、絨毛蛋白-1、V型質(zhì)子ATP合成酶F亞基、線粒體磷酸鹽載體蛋白、細(xì)胞色素b-c1復(fù)合物8亞基、多重耐藥抗性蛋白1、視黃醛脫氫酶2和尿調(diào)蛋白等。表1列出了差異較顯著的部分蛋白的歸屬及定量信息。

表1 人腎透明細(xì)胞癌組織差異蛋白質(zhì)

通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在腎透明細(xì)胞癌組織中, 許多腫瘤相關(guān)蛋白的表達(dá)發(fā)生了變化, 其中，值得注意的是, 在腫瘤組織中顯著上調(diào)的膜聯(lián)蛋白A4(ANXA4)。膜聯(lián)蛋白是一類廣泛分布于動(dòng)植物各種組織和細(xì)胞中的磷脂結(jié)合蛋白家族，能與磷脂膜、鈣離子可逆結(jié)合，調(diào)節(jié)膜通透性和膜運(yùn)輸，參與細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡。ANXA4是膜聯(lián)蛋白超家族中的重要成員之一，參與調(diào)節(jié)許多腫瘤相關(guān)的基因，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[29]。此外，ANXA4還通過(guò)調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，與腫瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移、血管發(fā)生和化療耐藥密切相關(guān)[30]。

3.4 MS1肽段峰強(qiáng)度數(shù)據(jù)對(duì)差異蛋白質(zhì)結(jié)果的驗(yàn)證

目前常用的非標(biāo)記定量分析方法是以MS1為基礎(chǔ)，計(jì)算每個(gè)肽段的信號(hào)強(qiáng)度在LC-MS色譜上的面積積分。利用基于MS1質(zhì)譜數(shù)據(jù)的定量方法對(duì)本研究所鑒定得到的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行驗(yàn)證，從鑒定結(jié)果中提取MS1相關(guān)的肽段峰強(qiáng)度、峰面積、液相色譜保留時(shí)間等特征信息。圖5顯示了膜聯(lián)蛋白A4中位于100～115的一條酶切肽段(GAGTDEGCLIEILASR)的定性分析和MS1定量分析的詳細(xì)結(jié)果。此肽段的分子離子峰為雙電荷，其m/z為831.4，洗脫時(shí)間為58.8 min(圖5A)。其MS2碎裂片段較完整，y系列碎片離子從y1到y(tǒng)12，b系列碎片離子從b3到b13(圖5B)。為了驗(yàn)證上述基于譜圖計(jì)數(shù)和MS2 TIC信息的定量分析結(jié)果，提取了各個(gè)分析樣本中此肽段的MS1豐度信息。結(jié)果顯示(圖5C)，此肽段在各個(gè)分析樣本中MS1豐度數(shù)據(jù)的變化趨勢(shì)與上述基于MS2數(shù)據(jù)的定量分析結(jié)果一致。

圖5 ANXA4肽段GAGTDEGCLIEILASR的色譜圖 (A)，MS2譜圖 (B)，以及該肽段在所有分析樣本中的MS1強(qiáng)度(C)Fig.5 Chromatogram of peptide (GAGTDEGCLIEILASR) from ANXA4 and its retention time (A), MS2 of this peptide (B), and MS1 intensity of distribution of this peptide in all samples (C)

4 結(jié) 論

腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，而晚期腎癌對(duì)化學(xué)療法或放射療法都不敏感，對(duì)其缺乏有效的診療分子靶標(biāo)。本研究應(yīng)用兩種基于MS2數(shù)據(jù)的非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法(譜圖計(jì)數(shù)和MS2 TIC法)，對(duì)晚期腎透明細(xì)胞癌和對(duì)應(yīng)正常組織樣本進(jìn)行了分析，并對(duì)兩種方法所得結(jié)果進(jìn)行了比較。本研究篩選出一系列與晚期腎癌密切相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，可作為腎透明細(xì)胞癌診治、預(yù)后判斷的候選標(biāo)志物，為尋找晚期腎透明細(xì)胞癌有效的治療靶點(diǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。