熒光成像-電感耦合等離子體質(zhì)譜關(guān)聯(lián)定量分析細(xì)胞內(nèi)銅納米粒子

鄭安琪 郝亞男 果婷婷 舒 楊 王建華

(東北大學(xué)理學(xué)院化學(xué)系， 沈陽(yáng) 110819)

1 引 言

在金屬納米粒子中，銅納米粒子(CuNPs)由于具有獨(dú)特的物理化學(xué)性質(zhì)和低廉的制備成本[1,2]，被廣泛用于抗菌[3]、癌癥治療[4]和生物傳感[5]等領(lǐng)域。但是，很多研究表明，CuNPs的大量使用可能對(duì)環(huán)境和人類健康造成潛在威脅。研究發(fā)現(xiàn)，CuNPs的毒性與其粒徑或比表面積高度相關(guān)[6]。通常，CuNPs的粒徑越小，其毒性越大[7]。向小鼠鼻腔內(nèi)滴注CuNPs會(huì)導(dǎo)致其在肝、肺組織中聚集[8]。在低pH值的胃液中，CuNPs會(huì)產(chǎn)生易溶的Cu2+，對(duì)肝臟、腎臟造成損害[9,10]。因此，準(zhǔn)確、及時(shí)地定量分析活細(xì)胞中的CuNPs，對(duì)于CuNPs的轉(zhuǎn)化和毒性機(jī)制的研究具有重要意義。

目前，對(duì)于CuNPs的定量分析，可先將其消化為Cu2+[11]，然后再通過熒光光譜法[12]、原子光譜法[13]、電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)[14]等分析方法進(jìn)行檢測(cè)。熒光檢測(cè)法由于具有簡(jiǎn)單、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)而受到廣泛關(guān)注[15～17]。盡管發(fā)光CuNPs在細(xì)胞內(nèi)成像的熒光信號(hào)與細(xì)胞內(nèi)的銅含量直接相關(guān)，但由于缺乏合適的校正方法，細(xì)胞內(nèi)CuNPs的定量分析仍然具有很大的挑戰(zhàn)。

本研究建立了一種熒光成像定量分析細(xì)胞內(nèi)CuNPs的方法。以谷胱甘肽包裹的近紅外發(fā)光的銅納米粒子(GSH-CuNPs)為研究模型，將其與MCF-7細(xì)胞孵育后，在激發(fā)波長(zhǎng)559 nm、發(fā)射波長(zhǎng)600～700 nm條件下， 利用共聚焦顯微鏡對(duì)MCF-7細(xì)胞中的GSH-CuNPs進(jìn)行熒光成像定量分析。將細(xì)胞裂解、離心超濾后，收集細(xì)胞攝入的GSH-CuNPs，用ICP-MS對(duì)細(xì)胞中GSH-CuNPs中對(duì)應(yīng)的銅進(jìn)行定量分析。將細(xì)胞中GSH-CuNPs的平均熒光強(qiáng)度與ICP-MS測(cè)得的定量分析數(shù)據(jù)相關(guān)聯(lián)，建立基于熒光成像對(duì)細(xì)胞內(nèi)GSH-CuNPs的平均含量進(jìn)行定量分析的方法。由于熒光成像圖像中顯示單個(gè)細(xì)胞的熒光差異，據(jù)此可以計(jì)算單個(gè)細(xì)胞內(nèi)GSH-CuNPs的含量。應(yīng)用本方法可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)CuNPs在MCF-7細(xì)胞中的動(dòng)力學(xué)轉(zhuǎn)化行為。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器與試劑

F-7000熒光分光光度計(jì)、U-3900紫外可見分光光度計(jì)(日本日立公司); Nicolet-6700傅里葉變換紅外光譜儀(美國(guó)賽默飛公司); FV1200共聚焦熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司); 7500a電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國(guó)安捷倫公司); JEM 2100 PLUS透射電子顯微鏡(TEM，日本歐捷路公司); 絕對(duì)熒光量子產(chǎn)率光譜儀(日本Hamamatsu公司)。

NaCl、KCl、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、谷胱甘肽 (GSH)購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司; Dulbecco's modified eagle medium培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶(0.25%)、青霉素、鏈霉素購(gòu)于上海賽默飛世爾科技有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為去離子水(電導(dǎo)率為18 MΩ·cm)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 Cu-GSH配合物的制備采用文獻(xiàn)[18]的方法制備二價(jià)銅-谷胱甘肽(Cu-GSH)配合物。首先，將0.25 mmol CuCl2和0.25 mmol 谷胱甘肽在10 mL去離子水中混合。然后，加入NaOH稀溶液將混合物調(diào)至pH ≈7，在室溫下保存一周，直到其顏色由淺黃色逐漸變?yōu)樗{(lán)色，表明形成了Cu-GSH配合物。在Cu-GSH溶液中加入30 mL乙醇， 15000 r/min離心3 min，棄去上清液，收集沉淀物，用N2吹干，保存，備用。

2.2.2 GSH-CuNPs的制備根據(jù)文獻(xiàn)[18]的方法制備GSH-CuNPs。取Cu-GSH配合物水溶液4.8 mL，分散在45 mL去離子水中，然后加入2 mL硼氫化鈉溶液(4.8 mol/L)。將混合物磁力攪拌10 min， 用稀HCl溶液調(diào)至pH ≈4。將此溶液在室溫下連續(xù)攪拌30 min，加入100 mL乙醇，以9000 r/min離心5 min，收集沉淀物。經(jīng)N2吹干， 得到GSH-CuNPs，在4℃下保存， 備用。

2.2.3 細(xì)胞內(nèi)GSH-CuNPs熒光成像MCF-7細(xì)胞接種到25 mm玻璃共聚焦培養(yǎng)皿，在含有10%胎牛血清、1%青霉素、1%鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃和5% CO2環(huán)境下生長(zhǎng)12 h后，移去培養(yǎng)基， 再加入1 ml 磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH≈7.4)洗去殘余的培養(yǎng)基。隨后，加入含不同濃度GSH-CuNPs的DMEM培養(yǎng)基(4、20、40、80和130 μg/mL)，在37℃，5% CO2環(huán)境下孵育1.5 h，通過共聚焦顯微鏡獲得細(xì)胞的熒光成像圖像，激發(fā)波長(zhǎng)559 nm，發(fā)射波長(zhǎng)600～700 nm。

探究孵育時(shí)間對(duì)細(xì)胞攝入GSH-CuNPs的影響。將130 μg/mL GSH-CuNPs溶液分別與MCF-7細(xì)胞在37℃、5% CO2環(huán)境下孵育0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h，在激發(fā)波長(zhǎng)559 nm、發(fā)射波長(zhǎng)600～700 nm條件下獲得細(xì)胞的熒光成像圖像。

研究GSH-CuNPs在細(xì)胞內(nèi)的分解與轉(zhuǎn)化。MCF-7細(xì)胞與含有GSH-CuNPs(130 μg/mL)的DMEM溶液在37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)1.5 h后，移去培養(yǎng)基。加入1 mL PBS(pH ≈7.4)洗去殘余的培養(yǎng)基。加入新鮮且不含GSH-CuNPs的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)50 min。利用共聚焦顯微鏡，在激發(fā)波長(zhǎng)559 nm、發(fā)射波長(zhǎng)600～700 nm條件下獲得MCF-7細(xì)胞在總培養(yǎng)時(shí)間為100、110、120、130和140 min時(shí)的熒光圖像。

2.2.4 ICP-MS測(cè)定細(xì)胞內(nèi)GSH-CuNPs對(duì)應(yīng)的銅含量及其與熒光成像的關(guān)聯(lián)MCF-7細(xì)胞與GSH-CuNPs孵育后，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板法測(cè)定培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)細(xì)胞數(shù)目。向貼壁的細(xì)胞中加入胰蛋白酶，消化1 min。900 r/min 離心3 min，收集細(xì)胞。加入1 mL PBS (pH≈7.4) 洗滌兩次，除去細(xì)胞懸浮液中的胰蛋白酶。然后，將細(xì)胞分散在3 mL PBS中。取10 μL 細(xì)胞懸浮液，滴于潔凈的血球計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)區(qū)，并用蓋玻片覆蓋。靜置片刻，待細(xì)胞沉降在計(jì)數(shù)板上，將血球計(jì)數(shù)板放置于顯微鏡的載物臺(tái)上進(jìn)行計(jì)數(shù)。900 r/min離心3 min,收集計(jì)數(shù)后的細(xì)胞，并重新分散在去離子水中，超聲處理促進(jìn)細(xì)胞裂解。對(duì)細(xì)胞裂解液進(jìn)行離心超濾(10k MWCO， Millipore)，以去離子水洗滌3次，除去可溶性銅。分3次向超濾離心管中加入500 μL去離子水，用移液槍吹洗，收集細(xì)胞釋放出的GSH-CuNPs。

根據(jù)文獻(xiàn)[19]報(bào)道的方法，用新制備的HNO3-H2O2(3∶1,V/V)溶液將收集到的GSH-CuNPs消解。在自然界中，銅有兩種穩(wěn)定同位素(63Cu和65Cu)，豐度分別為69.17%和 30.83%。本研究選擇豐度較大的63Cu同位素用于ICP-MS測(cè)定(等離子氣體Ar： 15.00 L/min，輔助氣體Ar：1.00 L/min，載氣Ar：1.00 L/min)，獲得細(xì)胞中GSH-CuNPs對(duì)應(yīng)的銅含量，以溶液中總GSH-CuNPs對(duì)應(yīng)的銅含量除以細(xì)胞總個(gè)數(shù)，可以得出單個(gè)細(xì)胞中的銅平均含量。

用新制備的HNO3-H2O2(3∶1,V/V)溶液消化MCF-7細(xì)胞懸浮液。用ICP-MS測(cè)定63Cu同位素，以獲得細(xì)胞內(nèi)的總銅含量(含GSH-CuNPs及其它結(jié)合態(tài)的Cu和Cu)，從而可計(jì)算出單個(gè)細(xì)胞中的總銅含量。

采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)ICP-MS檢測(cè)結(jié)果(MCF-7細(xì)胞內(nèi)熒光性GSH-CuNPs對(duì)應(yīng)的銅含量： fg/cell)與熒光成像結(jié)果(熒光密度：像素)進(jìn)行相關(guān)性分析，得到細(xì)胞熒光成像的熒光強(qiáng)度值與細(xì)胞內(nèi)GSH-CuNPs對(duì)應(yīng)的銅含量之間的線性關(guān)系。

3 結(jié)果與討論

3.1 細(xì)胞中GSH-CuNPs的熒光成像

以GSH為還原劑和穩(wěn)定劑，制備了熒光GSH-CuNPs。采用TEM對(duì)GSH-CuNPs的形貌進(jìn)行了表征，如圖1A所示，GSH-CuNPs具有四邊形結(jié)構(gòu)，平均粒徑為(55.1±10.9) nm。利用動(dòng)態(tài)光散射法測(cè)得GSH-CuNPs的水合粒徑為(66.6±5.6) nm(圖1B)。在GSH、Cu-GSH和GSH-CuNPs的紅外光譜中，1650和1560 cm-1處的峰分別為和的特征伸縮振動(dòng)吸收峰，說明在Cu-GSH中GSH與Cu形成配合物，GSH接枝到納米粒子表面?？疾炝薌SH-CuNPs的熒光發(fā)射特性，當(dāng)激發(fā)波長(zhǎng)為550 nm時(shí)，GSH-CuNPs水溶液的最大發(fā)射波長(zhǎng)為631 nm，其熒光量子產(chǎn)率為1.40%±0.26%。在本研究中，以共聚焦顯微鏡進(jìn)行熒光成像時(shí)，選擇559 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，并收集600～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的熒光發(fā)射。

圖1 (A) GSH-CuNPs的TEM圖像(插圖為GSH-CuNPs的粒徑分布); (B) 由DLS測(cè)得的GSH-CuNPs的水合粒徑分布; (C) GSH、Cu-GSH和GSH-CuNPs的紅外光譜; (D) GSH-CuNPs溶液的紫外-可見吸收、熒光激發(fā)和熒光發(fā)射光譜Fig.1 (A) Transmission electron microscopy (TEM) image of glutathione-copper nanoparticles (GSH-CuNPs) (Inset: particle size distribution of GSH-CuNPs)； (B) Size distribution of GSH-CuNPs measured by dynamic light scattering (DLS)； (C) Fourier transform-infrared (FT-IR) spectra of GSH, Cu-GSH and GSH-CuNPs； (D) Ultraviolet-visible absorption, fluorescence excitation and emission spectra of GSH-CuNPs

研究了GSH-CuNPs在DMEM中的轉(zhuǎn)化性能。在210 min內(nèi)，每間隔30 min測(cè)量1 mg/mL GSH-CuNPs在DMEM培養(yǎng)基中的熒光光譜(圖2A)，同時(shí)記錄最大熒光強(qiáng)度值。圖2B表明，隨時(shí)間延長(zhǎng)，GSH-CuNPs的熒光強(qiáng)度逐漸降低，至90 min時(shí)，熒光強(qiáng)度降至初始熒光強(qiáng)度的50%左右。記錄初始與210 min后GSH-CuNPs的DMEM溶液顏色變化(圖2B插圖)，可以觀察到，溶液由淡黃色轉(zhuǎn)變?yōu)闇\藍(lán)色，即有Cu-GSH產(chǎn)生。這一現(xiàn)象說明，在生理環(huán)境中，GSH-CuNPs 可轉(zhuǎn)化為不發(fā)光的Cu-GSH。

圖2 (A) 含1 mg/mL GSH-CuNPs的DMEM在不同時(shí)間的熒光發(fā)射光譜(0、30、60、90、120、150、180和210 min); (B) 含1 mg/mL GSH-CuNPs的DMEM在不同時(shí)間的最大熒光強(qiáng)度(插圖為起始(左)及210 min時(shí)(右)含GSH-CuNPs的DMEM圖片)Fig.2 (A) Fluorescence spectra of GSH-CuNPs in DMEM (1 mg/mL) at different time (0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 and 210 min); (B) Maximum fluorescence intensity of GSH-CuNPs at different time (Inset: the image of GSH-CuNPs in DMEM solution at 0 (left)and 210 min (right), respectively)

不同濃度的GSH-CuNPs溶液(4、20、40、80、130、170、200和220 μg/mL)與細(xì)胞共孵育1.5 h后，在激發(fā)波長(zhǎng)559 nm、發(fā)射波長(zhǎng)600～700 nm條件下獲得GSH-CuNPs在細(xì)胞內(nèi)的熒光成像圖(圖3)。由圖3可見，細(xì)胞中的熒光強(qiáng)度隨培養(yǎng)基中GSH-CuNPs的濃度增加而增大。用Image J 軟件處理熒光成像圖，獲得細(xì)胞內(nèi)GSH-CuNPs平均熒光密度(圖4A)。結(jié)果表明，當(dāng)GSH-CuNPs濃度超過170 μg/mL后，細(xì)胞中的平均熒光密度基本保持不變。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇GSH-CuNPs的濃度為4～170 μg/mL。

圖3 MCF-7細(xì)胞與不同濃度GSH-CuNPs溶液(4、20、40、80、130、170、200和220 μg/mL)孵育1.5 h后的熒光成像圖像Fig.3 Fluorescence images of MCF-7 cells after incubation for 1.5 h with different concentrations of GSH-CuNPs at 4， 20， 40， 80， 130 ，170， 200 and 220 μg/mL

與GSH-CuNPs孵育的細(xì)胞經(jīng)裂解后，采用超濾離心收集細(xì)胞內(nèi)的GSH-CuNPs。GSH-CuNPs經(jīng)新配制的HNO3-H2O2(3∶1,V/V)消化后，用ICP-MS測(cè)定銅元素的含量(圖4B)。當(dāng)培養(yǎng)基中GSH-CuNPs的濃度分別為4、20、40、80和130 μg/mL時(shí)，細(xì)胞內(nèi)GSH-CuNPs所對(duì)應(yīng)的銅平均含量分別為15.4、34.4、52.2、70.7和185.6 fg/cell。采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)ICP-MS測(cè)定的MCF-7細(xì)胞中GSH-CuNPs對(duì)應(yīng)的銅含量(fg/cell)與熒光成像結(jié)果(熒光密度)進(jìn)行相關(guān)性分析，在15.35～185.61 fg/cell濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)GSH-CuNPs中的銅含量與平均熒光密度呈線性關(guān)系，線性方程為F=2.36×10-4[Cu]+0.0396(圖4C)。

圖4 MCF-7細(xì)胞與不同濃度GSH-CuNPs溶液(4、20、40、80、130、170、200和220 μg/mL)孵育1.5 h后(A) 通過Image J軟件計(jì)算得到的細(xì)胞平均熒光密度、 (B) 通過ICP-MS測(cè)定的細(xì)胞中GSH-CuNPs對(duì)應(yīng)的銅含量和(C) 細(xì)胞中GSH-CuNPs對(duì)應(yīng)的銅含量與細(xì)胞內(nèi)熒光成像的平均熒光密度之間的線性關(guān)系Fig.4 (A) Variation of mean fluorescence intensity in the fluorescence images analyzed by the image J software， (B) Cu content corresponding to intracellular GSH-CuNPs nanoparticles detected by inductively coupled plasmon-mass spectrometry (ICP-MS) and (C) Linear relationship between copper content corresponding to intracellular GSH-CuNPs nanoparticles and mean fluorescence intensity in intracellular images of GSH-CuNPs in MCF-7 cells after incubated with GSH-CuNPs for 1.5 h at 4, 20, 40, 80, 130, 170, 200 and 220 μg/mL, respectively

圖5 MCF-7細(xì)胞與4、20、 40、80和130 μg/mL GSH-CuNPs孵育1.5 h后，細(xì)胞內(nèi)總銅、GSH-CuNPs、可溶性銅的含量Fig.5 Content of total Cu, GSH-CuNPs and other Cu species in MCF-7 cells after incubation for 1.5 h with GSH-CuNPs at 4, 20, 40, 80 and 130 μg/mL

為檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總銅含量，裂解后的細(xì)胞不經(jīng)離心超濾，用新配制的HNO3-H2O2(3∶1,V/V)溶液消化后進(jìn)行ICP-MS檢測(cè)(圖5)。結(jié)果表明，ICP-MS測(cè)定的細(xì)胞內(nèi)總銅含量與培養(yǎng)基中GSH-CuNPs的濃度密切相關(guān)。當(dāng)培養(yǎng)基中GSH-CuNPs的濃度分別為4、20、40、80和130 μg/mL時(shí)，經(jīng)過細(xì)胞計(jì)數(shù)，ICP-MS測(cè)得細(xì)胞內(nèi)所有形態(tài)銅的平均總含量分別為22.4、62.0、143.3、167.5和256.6 fg/cell。根據(jù)總銅含量與細(xì)胞內(nèi)GSH-CuNPs中銅含量之差，可得到細(xì)胞內(nèi)其它可溶性銅的平均含量分別為7.1、27.7、91.1、96.8和71.0 fg/cell。在細(xì)胞內(nèi)，內(nèi)源性銅易與金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、金屬伴侶等蛋白質(zhì)結(jié)合，以維持銅在體內(nèi)的平衡[20]。未與GSH-CuNPs孵育時(shí)，細(xì)胞中的內(nèi)源性銅含量為(5.4 ± 2.2) fg/cell。孵育后，GSH-CuNPs納米顆粒在細(xì)胞內(nèi)分解代謝成可溶性銅的含量分別為1.9、22.3、85.8、91.4和65.6 fg/cell。上述結(jié)果表明，GSH-CuNPs納米顆粒被細(xì)胞攝入后，部分被細(xì)胞代謝轉(zhuǎn)化為其它形態(tài)的可溶性銅。

3.2 孵育時(shí)間對(duì)細(xì)胞攝入GSH-CuNPs的影響

圖6 (A) MCF-7細(xì)胞與GSH-CuNPs溶液(130 μg/mL)孵育3 h的熒光成像圖; (B) 通過Image J軟件計(jì)算得到細(xì)胞平均熒光密度與細(xì)胞內(nèi)GSH-CuNPs對(duì)應(yīng)的銅含量的關(guān)系(fg/cell)Fig.6 (A) Fluorescence images of MCF-7 cells after incubated with 130 μg/mL of GSH-CuNPs nanoparticles for 3 h; (B) Variation of the mean fluorescence intensity in the images and the Cu content corresponding to the intracellular GSH-CuNPs (fg/cell)

采用上述建立的定量分析方法研究了孵育時(shí)間對(duì)細(xì)胞攝入GSH-CuNPs的影響。將MCF-7細(xì)胞與GSH-CuNPs溶液(130 μg/mL)孵育不同時(shí)間，通過共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行熒光成像。采用Image J軟件計(jì)算得到平均熒光密度，并計(jì)算出細(xì)胞內(nèi)GSH-CuNPs對(duì)應(yīng)的銅含量。如圖6A所示，隨著細(xì)胞孵育時(shí)間延長(zhǎng)，熒光密度逐漸增加，在孵育時(shí)間為1.5 h時(shí)達(dá)到最大值，此時(shí)細(xì)胞內(nèi)GSH-CuNPs對(duì)應(yīng)的銅平均含量為176.1 fg/cell，這是由于發(fā)光的GSH-CuNPs逐漸積聚到細(xì)胞質(zhì)中所致。在接下來(lái)的1.5 h內(nèi)，熒光強(qiáng)度開始下降，在3 h時(shí),細(xì)胞內(nèi)GSH-CuNPs對(duì)應(yīng)的銅含量為49.76 fg/cell (圖6B)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,GSH-CuNPs在細(xì)胞中不穩(wěn)定，在細(xì)胞內(nèi)解離成不發(fā)光的可溶性銅，導(dǎo)致熒光減弱; 同時(shí)，部分GSH-CuNPs經(jīng)MCF-7細(xì)胞代謝排至細(xì)胞外[21]。

通過熒光成像明場(chǎng)圖像觀察與GSH-CuNPs孵育后細(xì)胞的形態(tài)。隨孵育時(shí)間延長(zhǎng)至3 h，細(xì)胞逐漸縮小變圓，顯示細(xì)胞逐漸凋亡。CuNPs會(huì)通過線粒體路徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并且導(dǎo)致活性氧物種產(chǎn)生，誘導(dǎo)DNA鏈斷裂和細(xì)胞膜損傷[22,23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，大量GSH-CuNPs解離成可溶性銅，這與體外探究GSH-CuNPs降解的結(jié)果一致。當(dāng)銅超載時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的金屬硫蛋白被耗盡，因此細(xì)胞迅速失去對(duì)銅毒性的抵抗，導(dǎo)致細(xì)胞活力的喪失[9]。

3.3 GSH-CuNPs在細(xì)胞中的代謝動(dòng)力學(xué)

MCF-7細(xì)胞與GSH-CuNPs溶液(130 μg/mL)孵育1.5 h后，用PBS溶液洗滌去除MCF-7細(xì)胞表面吸附的GSH-CuNPs，加入新鮮的DMEM溶液(不含GSH-CuNPs)，繼續(xù)培養(yǎng)50 min。利用共聚焦顯微鏡，在激發(fā)波長(zhǎng)559 nm、發(fā)射波長(zhǎng)600～700 nm條件下獲得細(xì)胞熒光圖像(圖7A)，發(fā)現(xiàn)隨著孵育時(shí)間延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度明顯降低。根據(jù)3.1節(jié)的線性標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到細(xì)胞內(nèi)對(duì)應(yīng)GSH-CuNPs的銅含量(圖7B)。在50 min的孵育時(shí)間內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)GSH-CuNPs對(duì)應(yīng)的銅含量由172.74 fg/cell降低至18.66 fg/cell。此結(jié)果表明，GSH-CuNPs在細(xì)胞內(nèi)快速代謝。

圖7 將MCF-7細(xì)胞先與GSH-CuNPs溶液(130 μg/mL)孵育1.5 h后 (A) 繼續(xù)在不含GSH-CuNPs的DMEM溶液中培養(yǎng)50 min內(nèi)的熒光成像變化情況和(B) MCF-7細(xì)胞內(nèi)GSH-CuNPs對(duì)應(yīng)的銅含量的變化情況Fig.7 (A) Variation of fluorescence images followed by further culturing for 50 min in DMEM medium and (B) variation of the intracellular Cu content corresponding to GSH-CuNPs in MCF-7 cells with the incubation time in DMEM medium after MCF-7 cells incubated with 130 μg/mL of GSH-CuNPs solution

4 結(jié) 論

通過統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)細(xì)胞熒光成像與ICP-MS檢測(cè)的數(shù)據(jù)，建立了一種基于熒光成像對(duì)細(xì)胞內(nèi)的CuNPs進(jìn)行定量分析的新方法。本方法兼具熒光成像實(shí)時(shí)、原位和無(wú)損的優(yōu)點(diǎn)，以及ICP-MS的高靈敏定量分析分析功能，可對(duì)細(xì)胞內(nèi)的CuNPs進(jìn)行原位與實(shí)時(shí)定量分析。采用ICP-MS測(cè)定細(xì)胞內(nèi)的總銅含量，進(jìn)而計(jì)算得到CuNPs進(jìn)入細(xì)胞后溶解代謝出的可溶性銅含量，由此研究了CuNPs在MCF-7細(xì)胞中的代謝動(dòng)力學(xué)。本方法為研究活體細(xì)胞中金屬納米粒子的吸收、分布、代謝及其排泄提供了一種新思路，對(duì)納米材料生物毒性研究具有重要的意義。