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    膜萃取電噴霧電離質(zhì)譜快速分析菌血血樣的研究

    2020-10-22 02:24:50黃麗娟徐貞俊徐靜娟陳洪淵
    分析化學(xué) 2020年10期
    關(guān)鍵詞:血樣戊酸銅綠

    王 姜 黃麗娟 徐貞俊 劉 昱 徐靜娟* 陳洪淵

    1(南京大學(xué)生命分析化學(xué)國家重點實驗室,南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院, 南京 210023) 2(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院心胸外科, 南京 210008)

    1 引 言

    血流感染(Bloodstream infection, BSI),如菌血癥、敗血癥等,是一類可對人體健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅的疾病,嚴(yán)重者可引起全身炎癥反應(yīng)綜合征,甚至死亡[1,2]。新生兒、手術(shù)后的病人、癌癥患者、艾滋病病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)感染者及抵抗力低下的外傷人員等,都是該類疾病的易感人群[1,3~8]。由金黃色葡萄球菌引起的菌血癥, 30天全因病死率可達(dá)20%,如救治不及時,死亡率可高于80%[9,10]。我國BSI平均死亡率高達(dá)27.8%,由燒傷、血液病、惡性腫瘤誘發(fā)BSI病死率更高[11,12]。準(zhǔn)確快速檢測BSI患者所感染細(xì)菌種類,為臨床診斷提供參考,對降低死亡率至關(guān)重要[13,14]。血流感染的診斷金標(biāo)準(zhǔn)為血液培養(yǎng)法[15,16],但對血液樣本培養(yǎng)診斷時間為2~5天,并存在假陰性等問題[17,18],其它輔助檢測手段(如血清降鈣素原檢測)也無法快速、有效地確認(rèn)細(xì)菌種類[17,19]。

    為了提高細(xì)菌的檢測效率和準(zhǔn)確性,研究者開發(fā)了多種有效檢測方法,如酶聯(lián)免疫法[20]、協(xié)同凝集法[21]、微流控芯片篩分法[22~24]、毛細(xì)管電泳法[25,26]等。以上方法在一定程度上縮短了檢測時間,但仍然存在假陰性,或者難于滿足多種細(xì)菌高靈敏度檢測的需求。質(zhì)譜具有靈敏度高、檢測速度快等優(yōu)點,已廣泛應(yīng)用于化學(xué)、生物、醫(yī)學(xué)檢測等領(lǐng)域。在菌血癥的檢測中,Chingin等[14]通過質(zhì)譜檢測血液培養(yǎng)過程中細(xì)菌產(chǎn)生的揮發(fā)性物質(zhì),對不同細(xì)菌進(jìn)行區(qū)分,獲得了良好的結(jié)果。但該方法需要對血液樣品培養(yǎng)16 h左右,對BSI患者而言,培養(yǎng)時間仍然較長。因此,發(fā)展一種可在更短時間內(nèi)對臨床樣本進(jìn)行快速處理和檢測、準(zhǔn)確判斷患者所感染細(xì)菌種類的檢測方法,為患者贏得寶貴治療時間十分必要。

    膜萃取電噴霧質(zhì)譜(Membrane extraction electrospray ionization mass spectrometry, MEESI-MS)法是通過聚四氟乙烯微孔膜將樣品與萃取劑分隔,待測物質(zhì)通過微孔膜被萃取劑萃取并發(fā)生電離的一種在線萃取電離質(zhì)譜分析方法。根據(jù)待測分子的物化性質(zhì)可以調(diào)整和優(yōu)化萃取劑,以獲得較好的檢測效果。利用此方法已實現(xiàn)了牛奶中手性藥物的直接質(zhì)譜檢測[27]。本研究以臨床BSI患者血樣分離病原菌占比位列前四位的大腸桿菌(27.7%)、金黃色葡萄球菌(10.3%)、肺炎克雷伯菌(10.2%)、銅綠假單胞菌(7.1%)為研究對象[28,29],利用膜萃取具有的抗復(fù)雜基體干擾的能力,結(jié)合血液培養(yǎng),建立了一種對菌血血液樣品進(jìn)行快速分析的MEESI-MS方法。從血液培養(yǎng)、質(zhì)譜檢測到細(xì)菌分類分析,整個過程僅需65 min,為臨床診斷提供了一種快速分析方法。

    2 實驗部分

    2.1 儀器與試劑

    6530Q-TOF質(zhì)譜儀(安捷倫科技有限公司,分析軟件為儀器自帶Qualitative Analysis B.06.00); VD-850桌上型凈化工作臺(上海尚道儀器制造有限公司); THZ-100B恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科學(xué)儀器有限公司); VARI FLASH酶標(biāo)儀(美國Thermo Scientific公司); Pump 11 Elite注射泵(Harvard Apparatus公司); 0.45 μm聚四氟乙烯膜(邁博瑞生物膜技術(shù)有限公司)。乙酸(>99%,南京化學(xué)試劑股份有限公司); 甲醇(>99.9%,百靈威科技有限公司); 營養(yǎng)瓊脂(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司); LB肉湯(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。肺炎克雷伯氏菌菌株、大腸桿菌菌株、銅綠假單胞菌菌株、金黃色葡萄球菌菌株(上海魯微科技有限公司); 人血樣品由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院心胸外科提供(血液提供人員已知情并同意)。實驗用水為二次蒸餾水。

    2.2 膜萃取電噴霧電離裝置

    采用自制的膜萃取電噴霧電離裝置。如圖1A中的裝置示意圖所示,裝置由兩個金屬三通、一個自制的雙向連接器和聚四氟乙烯(PTFE)微孔膜組成。裝置中間為PTFE微孔膜,左側(cè)紅色管道是樣品引入通道,管道出口距離微孔膜1 mm; 藍(lán)色通道為萃取劑通道,萃取劑通道通過金屬三通與電噴霧毛細(xì)管相連; 電噴霧毛細(xì)管左側(cè)距離微孔膜1 mm。樣品由紅色通道進(jìn)入,待測物通過微孔膜,被萃取劑萃取后進(jìn)入電噴霧毛細(xì)管,并在高壓電場作用下發(fā)生電離。完成萃取后的樣品廢液由左側(cè)三通的廢液出口排出。實驗中,樣品流速控制在3 μL/min,萃取劑流速4 μL/min。

    2.3 樣品處理

    固態(tài)培養(yǎng)基:稱取營養(yǎng)瓊脂33.0 g,加1000 mL水,將其煮沸至營養(yǎng)瓊脂完全溶解,120℃高壓滅菌30 min后,制備成瓊脂平板,備用。

    液態(tài)培養(yǎng)基:稱取LB肉湯21.0 g,加1000 mL水, 120℃高壓滅菌30 min后,備用。

    細(xì)菌預(yù)培養(yǎng):在凈化工作臺中分別將肺炎克雷伯氏菌菌株、大腸桿菌菌株、銅綠假單胞菌菌株、金黃色葡萄球菌菌株接種到瓊脂平板上培養(yǎng)12 h,再挑取單獨菌落,置于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)16 h,獲得細(xì)菌母液。用生理鹽水稀釋細(xì)菌母液,制成102CFU/mL的接種菌液,備用。

    血液樣品分組:將血樣分為5組,第一組血液不添加細(xì)菌; 第二組血液添加金黃色葡萄球菌; 第三組血液添加大腸桿菌; 第四組血液添加銅綠假單胞菌; 第五組血液添加肺炎克雷伯氏菌。處理方法如下:取100 μL接種菌液加入1 mL無菌的人血樣本中,制成10 CFU/mL的菌血樣品,然后向菌血樣品中加入4 mL液態(tài)培養(yǎng)基,混勻,在培養(yǎng)搖床中37℃培養(yǎng)1 h。每組菌血樣本設(shè)置2個盲樣,共8個盲樣,在盲樣中抽取3個樣品(編號1、2、3)進(jìn)行主成分分析(Principal component analysis, PCA),分析后揭盲,驗證PCA方法的準(zhǔn)確性。

    2.4 數(shù)據(jù)的采集與處理

    質(zhì)譜儀采用正、負(fù)離子兩種檢測模式,離子源電壓為4.3 kV(正離子模式)和3.5 kV(負(fù)離子模式)。離子源電噴霧口至質(zhì)譜入口毛細(xì)管的距離為6.0 mm。質(zhì)譜離子源反吹氮氣流速為1.5 L/min,檢測掃描范圍為m/z50~3200,離子傳輸管溫度為220℃。串聯(lián)質(zhì)譜設(shè)置隔離質(zhì)量寬度為±4 Da,碰撞能量為10 eV。

    將質(zhì)譜數(shù)據(jù)(正離子模式下,無菌血液樣本及每種細(xì)菌樣本各10個; 負(fù)離子模式下,無菌血液樣本及每種細(xì)菌樣本各10個)導(dǎo)出,利用Matlab(2018版,美國Mathworks公司)軟件進(jìn)行PCA。

    3 結(jié)果與討論

    3.1 MEESI-MS方法驗證

    經(jīng)過培養(yǎng)的血液樣品由圖1A中紅色管道進(jìn)入MEESI裝置,血樣中待測物質(zhì)被膜右側(cè)的萃取劑(乙腈-水(1∶1,V/V),含0.1% 乙酸)萃取并電離,得到圖1B中的質(zhì)譜圖(正離子模式),其中m/z757 (+20)、m/z797 (+19)、m/z841 (+18)是血紅蛋白β鏈質(zhì)譜信號。這些信號表明,血液中的血紅蛋白可穿過微孔膜,被萃取劑萃取后進(jìn)入電噴霧管道,并發(fā)生電離而被質(zhì)譜檢測到。此結(jié)果說明,利用本裝置,在優(yōu)化的實驗條件下可獲取血樣中的物質(zhì)信息。

    圖1 (A) 膜萃取電噴霧電離質(zhì)譜(MEESI-MS)裝置示意圖; (B) 培養(yǎng)1 h的無菌血樣的MEESI-MS圖Fig.1 (A) Schematic diagram of membrane extraction electrospray ionization mass spectrometry (MEESI-MS) device; (B)MEESI-MS spectrum of normal blood samples cultured for 1 h

    根據(jù)文獻(xiàn)[14]報道,在菌血癥致病菌的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的檢測過程中,只在金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)異戊酸(Isovaleric acid)。 通過HMDB(Human metabolome database, www.hmdb.ca)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行精確質(zhì)量查找,確定在負(fù)離子模式下m/z101為異戊酸。在負(fù)離子模式下,對比培養(yǎng)時間為1、6和24 h的金黃色葡萄球菌血樣(圖2B、2D和2F)和正常血樣(圖2A、2C和2E)的指紋譜圖,發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌血樣中存在異戊酸,且異戊酸信號強度與樣品的培養(yǎng)時間呈正相關(guān)。在正常血樣的指紋譜圖中未發(fā)現(xiàn)異戊酸,與文獻(xiàn)[14]的結(jié)果相符。

    圖2 在負(fù)離子模式下血樣的MEESI質(zhì)譜圖:無菌血樣培養(yǎng)1 h(A)、6 h(C)和24 h(E); 金黃色葡萄球菌血樣培養(yǎng)1 h(B)、6 h(D)和24 h(F) Fig.2 MEESI-MS spectra of blood samples under negative ion mode: sterile blood samples cultured for 1 h (A), 6 h (C) and 24 h (E); Staphylococcus aureus blood samples cultured for 1 h (B), 6 h (D) and 24 h (F)

    為了進(jìn)一步確認(rèn)異戊酸,選擇m/z101分子離子峰進(jìn)行二級質(zhì)譜分析(圖3)。在培養(yǎng)1、6和24 h(圖3B、3D、3F)金黃色葡萄球菌血樣的二級質(zhì)譜中均獲得了主要碎片信息m/z83的信號和m/z73、57的碎片信號,碎片信息與文獻(xiàn)[14]報道的異戊酸的二級質(zhì)譜碎片信息相符,并且碎片信號強度也隨培養(yǎng)時間的延長而增強; 在培養(yǎng)1和6 h的正常血樣中未獲得異戊酸相關(guān)碎片信號(圖3A和3C),培養(yǎng)24 h的正常血樣中可獲得m/z83的碎片信號,但沒有m/z57和73的相關(guān)碎片信號(圖3E),說明樣品中不含有異戊酸。以上結(jié)果表明,MEESI-MS獲得的血液培養(yǎng)液中的信息可用于相關(guān)菌血樣品的分析。

    圖3 在負(fù)離子模式下血樣中m/z 101的二級質(zhì)譜圖:無菌血樣培養(yǎng)1 h(A)、6 h(C)和24 h(E); 金黃色葡萄球菌血樣培養(yǎng)1 h(B)、6 h(D)和24 h(F) Fig.3 Tandem mass spectra of blood samples (m/z 101) under negative ion mode: sterile blood samples cultured for 1 h (A), 6 h (C) and 24 h (E); Staphylococcus aureus blood samples cultured for 1 h (B), 6 h (D) and 24 h (F)

    3.2 4種細(xì)菌血液培養(yǎng)液MEESI-MS的指紋譜圖

    利用PCA方法對細(xì)菌進(jìn)行分析的關(guān)鍵是獲取不同細(xì)菌的特征代謝產(chǎn)物信息。本實驗對4種細(xì)菌血液培養(yǎng)液的MEESI-MS指紋譜圖進(jìn)行了對比分析。由于樣品成分復(fù)雜,很多物質(zhì)信號較弱,無法通過串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行分析。本研究將精確質(zhì)量與HMDB數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)進(jìn)行比對,獲得了部分與細(xì)菌代謝物質(zhì)相關(guān)的物質(zhì)信息(表1)。

    表1 不同細(xì)菌血樣的典型代謝產(chǎn)物

    在正離子模式下,在金黃色葡萄球菌血樣質(zhì)譜數(shù)據(jù)(圖4B)中出現(xiàn)m/z154,為去甲亞精胺(Norspermidine)的[M+Na]+信號; 在大腸桿菌血樣質(zhì)譜圖(圖4C)中出現(xiàn)m/z181,為5-甲基硫代核糖(5-Methylthioribose)的[M+H]+信號,此物質(zhì)是細(xì)菌在進(jìn)行蛋氨酸或半胱氨酸S回收反應(yīng)過程的中間產(chǎn)物,可在大腸桿菌代謝物中出現(xiàn)[30]; 在肺炎克雷伯菌血樣質(zhì)譜圖(圖4D)中發(fā)現(xiàn)m/z157,為二氫蝶呤(Dihydropteridine)的[M+Na]+信號,此物質(zhì)為二氫蝶呤還原酶底物,參與生物體合成四氫蝶呤[31,32]; 在銅綠假單胞菌血樣質(zhì)譜圖(圖4E)中發(fā)現(xiàn)m/z92和143,分別是羥甲基氨基甲酸((Hydroxymethyl) carbamic acid)的[M+H]+信號和嘌呤(Purine)的[M+Na]+信號,其中,嘌呤濃度與人體細(xì)菌感染有一定的正相關(guān)性[33],嘌呤也是銅綠假單胞菌的主要氮源[34]。

    圖4 在正離子模式下培養(yǎng)1 h的血樣的質(zhì)譜圖:(A)無菌血樣; (B)金黃色葡萄球菌血樣; (C)大腸桿菌血樣; (D)肺炎克雷伯菌血樣; (E)銅綠假單胞菌血樣Fig.4 Mass spectra of blood samples cultured for 1 h under positive ion mode: (A) Sterile blood sample; (B) Staphylococcus aureus blood sample; (C) Escherichia coli blood sample; (D) Klebsiella pneumoniae blood sample; (E) Pseudomonas aeruginosa blood sample

    在負(fù)離子模式下,在金黃色葡萄球菌血樣質(zhì)譜圖(圖2B)中發(fā)現(xiàn)m/z89,為乳酸(Lactic acid)的[M-H]-信號, 此物質(zhì)存在于多種細(xì)菌培養(yǎng)代謝產(chǎn)物中[35];m/z101為異戊酸的[M-H]-信號,此物質(zhì)曾在菌血癥患者血樣中被檢出[14]。大腸桿菌血樣質(zhì)譜圖(圖5A)中,m/z89為乳酸;m/z105為甘油酸(Glyceric acid)的[M-H]-信號,此物質(zhì)與微生物代謝有關(guān),是細(xì)菌將甘油轉(zhuǎn)化為二羥基丙酮的中間產(chǎn)物[36];m/z117為琥珀酸(Succinic acid)的[M-H]-信號,琥珀酸是多種革蘭氏陰性細(xì)菌都可產(chǎn)生的一種代謝產(chǎn)物[35];m/z156為2-氨基-2,4-己二烯二酸(2-Aminohexa-2,4-dienedioic acid)的[M-H]-信號。肺炎克雷伯菌血樣質(zhì)譜圖(圖5B)中,m/z117對應(yīng)琥珀酸;m/z156峰為2-氨基-2,4-己二烯二酸。在銅綠假單胞菌血樣質(zhì)譜圖(圖5C)中,m/z89為乳酸,m/z105為甘油酸。

    圖5 在負(fù)離子模式下培養(yǎng)1 h的血樣的質(zhì)譜圖:(A)大腸桿菌血樣; (B)肺炎克雷伯菌血樣; (C)銅綠假單胞菌血樣Fig.5 Mass spectra of blood samples cultured for 1 h under negative ion mode: (A) Escherichia coli blood sample; (B) Klebsiella pneumoniae blood sample; (C) Pseudomonas aeruginosa blood sample

    在負(fù)離子模式下,發(fā)現(xiàn)檢測到的物質(zhì)多為有機酸,這可能是由于酸性物質(zhì)在負(fù)離子模式下更容易電離。在負(fù)離子檢測結(jié)果中,每種細(xì)菌之間的代謝產(chǎn)物種類有較多的重疊,從質(zhì)譜圖中也可看出,負(fù)離子模式下,不同細(xì)菌的質(zhì)譜信號差異相對較小,信息量少于正離子模式。因此,本研究采用正離子模式下的數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析。

    3.3 主成分分析

    將MEESI-MS的正離子模式數(shù)據(jù)導(dǎo)入Matlab軟件中進(jìn)行PCA分析(圖6A),無菌血樣(Normal)、金黃色葡萄球菌血樣(SA)、大腸桿菌血樣(EC)、肺炎克雷伯菌血樣(KP)、銅綠假單胞菌血樣(PA)獲得了較為明顯的區(qū)分, 主成分PC1、PC2和PC3的貢獻(xiàn)率分別為72.8%、9.4%和3.5%,說明PC1對區(qū)分菌血樣品起主要作用。由圖6A可見,大腸桿菌樣品與其它樣品分離明顯,這可能是大腸桿菌活躍度相對其它3種細(xì)菌較高,差異更大,而另外3種細(xì)菌由于培養(yǎng)時間僅為1 h,不同種類細(xì)菌樣品間分離度有限。但從圖6A中可以清晰地區(qū)分不同細(xì)菌的區(qū)域,其中PA樣品中有1個樣品點與SA樣品的1個樣品點非常接近,整體50個樣品點中出現(xiàn)2個樣品點區(qū)分不明顯,占總樣品數(shù)的4%, 其它樣品點區(qū)分良好,區(qū)分正確率大于90%,可實現(xiàn)細(xì)菌種類初步鑒定。在盲樣(Sample)分析中,1號樣品為銅綠假單胞菌血樣,2號樣品為大腸桿菌血樣,3號樣品為金黃色葡萄球菌血樣,以上3個樣本通過本方法分析均獲得了準(zhǔn)確區(qū)分。

    在PCA分析的載荷圖(圖6B)中,差異最大的物質(zhì)為m/z101、102、116、127、143和175等。將以上物質(zhì)與上述檢出物質(zhì)進(jìn)行匹配,發(fā)現(xiàn)在PC1和PC3的載荷因子為負(fù)值的m/z143與銅綠假單胞菌樣品檢出的嘌呤相符。同時,銅綠假單胞菌樣品分布在PC1和PC3負(fù)軸,在PC2中分布在正軸一側(cè)(圖6A),這也佐證了m/z143為嘌呤。由于生物樣品物質(zhì)復(fù)雜,通過相關(guān)數(shù)據(jù)庫搜索和文獻(xiàn)查找,其它差異較大的譜峰的物質(zhì)信息難以確認(rèn),但對本研究中細(xì)菌種類的區(qū)分不會造成影響。

    圖6 正常血樣及四種菌血樣品正離子模式下質(zhì)譜數(shù)據(jù)的三主成分分析散點圖(每種樣品十個樣品點)(A)和載荷圖(B)Fig.6 Principal component analysis (PCA) results of MEESI-MS data under positive ion mode originating from normal blood samples and four kinds of bacterial blood samples: (A) Scatter plot of PCA with ten sample points for each sample; (B) PC1, PC2 and PC3 loading results

    3.4 分析速度和穩(wěn)定性

    本研究中,菌血樣品培養(yǎng)時間約60 min,整體分析時間少于65 min,因此,可滿足對批量樣品進(jìn)行快速分析的需求。本研究還對分析方法的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察,實驗中單個樣品重復(fù)進(jìn)樣6次,經(jīng)計算,在正、負(fù)離子模式下檢測到的物質(zhì)信號的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為16.3%和7.7%。說明本研究所采用的方法能夠在短時間血液培養(yǎng)后,快速鑒別4種細(xì)菌血樣,檢測效果良好。

    4 結(jié) 論

    利用MEESI-MS技術(shù)結(jié)合血液培養(yǎng)對4種細(xì)菌血樣進(jìn)行快速分析,得到對應(yīng)的指紋圖譜,并對其中常見的化學(xué)成分(異戊酸等)進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜鑒定。將MEESI-MS與PCA方法相結(jié)合,可在1 h左右直接對4種細(xì)菌血樣進(jìn)行快速區(qū)分,區(qū)分正確率大于90%。本方法所需血樣中細(xì)菌起始濃度與臨床疾病血樣樣本濃度[15]相當(dāng),具有分析速度快、方法簡單等特點。雖然不能實現(xiàn)邊界分明的區(qū)分效果,但已可以明確地進(jìn)行細(xì)菌種類初步判斷,為臨床治療提供信息支撐,爭取寶貴的治療時間。本研究使用的樣品不是實際病例樣品,相較于實際病例樣品,細(xì)菌與血液接觸時間更短,區(qū)分難度更大。因此,通過PCA算法的改進(jìn)及大量實際樣本的機器學(xué)習(xí),本方法可望為臨床血液感染類疾病的快速檢測提供一種新手段。

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