普羅米修斯之火
——肝臟再生和研究范式轉(zhuǎn)換

普羅米修斯是希臘神話中的英雄，他用黏土創(chuàng)造了人類，并且違抗宙斯的命令，盜火給了人類，最后使得自己在高加索山脈上接受宙斯的懲罰：每天惡鷹會(huì)來啄食普羅米修斯的肝臟，而他的肝臟又會(huì)在夜晚重新生長出來。為了人類能擁有光明和溫暖，他必須日復(fù)一日地忍受這種痛苦。這個(gè)神話刻畫了普羅米修斯為人類獻(xiàn)身的英雄主義，普羅米修斯之火也成了引導(dǎo)人類進(jìn)步的象征。有意思的是，這個(gè)神話還描述了一個(gè)生命的奇跡，即肝臟的強(qiáng)大再生能力。

肝臟是體內(nèi)最重要的器官之一，發(fā)揮著代謝、分泌、解毒等多種生理功能。肝臟從大體上來看，是一個(gè)相對(duì)均質(zhì)的組織。從具體的構(gòu)建細(xì)節(jié)來看，肝臟是由一個(gè)一個(gè)的肝小葉作為基本功能結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的。肝小葉可以大致想象成一個(gè)多邊形的結(jié)構(gòu)，中心區(qū)域是中央靜脈；幾個(gè)頂點(diǎn)是匯管區(qū)存在的地方，匯管區(qū)內(nèi)有肝動(dòng)脈，門靜脈和膽管。肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞是構(gòu)成肝臟的主要細(xì)胞類型，前者是肝臟內(nèi)最重要的功能細(xì)胞，占肝臟總重量的約80%。肝細(xì)胞從中央靜脈排列成索狀，一直到匯管區(qū)。動(dòng)脈和門靜脈的血液經(jīng)過肝索間內(nèi)皮細(xì)胞形成的肝竇中流入中央靜脈。肝細(xì)胞和肝細(xì)胞之間會(huì)形成膽小管的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞分泌的膽汁流入膽小管，通過互相間連接的膽小管，最后匯入由膽管上皮細(xì)胞構(gòu)成的膽管中。肝臟中還有一些免疫細(xì)胞、星型細(xì)胞等，分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞周圍或者肝竇間隙中。

哺乳動(dòng)物的大多數(shù)組織器官都缺乏再生完整器官的能力，但肝臟是個(gè)例外。在極端情況下，肝臟被切除高達(dá)70%后，殘余的肝組織仍然可以在2周左右的時(shí)間內(nèi)再生出整個(gè)肝臟器官來（盡管其外觀的大體結(jié)構(gòu)并不能被再生出來）。在其他一些急性化學(xué)性損傷過程中，肝臟也往往能夠非常好地再生損傷組織。但當(dāng)受到持續(xù)性損傷時(shí)，比如慢性病毒感染、脂肪性肝炎、長期藥物肝損傷等，肝臟的再生修復(fù)能力會(huì)遭到破壞，常會(huì)出現(xiàn)肝纖維化等病理狀態(tài)，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致肝硬化和肝衰竭，危及病人的生命。

肝臟是再生研究的熱點(diǎn)器官

由于肝臟的強(qiáng)大再生能力，并且肝臟再生與相當(dāng)多的肝臟病理變化相關(guān)，因此肝臟一直是再生研究領(lǐng)域中深受關(guān)注的器官。肝臟再生過程有相當(dāng)多非常有意思的科學(xué)問題，比如：再生過程的誘導(dǎo)因素是什么，而組織完成再生后，整個(gè)過程又是如何被恰到好處地終止；再生過程的血管和膽管重建問題；免疫細(xì)胞對(duì)肝臟再生的作用；衰老狀態(tài)下，再生能力下降的原因等等。但在這些問題中，一個(gè)核心的關(guān)注點(diǎn)是，肝細(xì)胞作為最重要的功能細(xì)胞，是如何被再生出來的，其細(xì)胞來源是什么，涉及哪些調(diào)控的因子？

20世紀(jì)中后期，對(duì)肝臟再生的研究主要是形態(tài)學(xué)描述，比如利用光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡，進(jìn)行組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞形態(tài)方面的觀察。研究者主要采用肝臟切除模型來研究肝臟再生。在這個(gè)過程中，觀察到在很短時(shí)間內(nèi)，肝細(xì)胞就出現(xiàn)了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變形、線粒體減少等變化；在肝臟切除大約24小時(shí)左右，肝細(xì)胞出現(xiàn)了細(xì)胞分裂象，提示肝細(xì)胞正在發(fā)生增殖。隨著同位素標(biāo)記和核酸標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，人們可以真正跟蹤肝細(xì)胞增殖過程中細(xì)胞遺傳物質(zhì)——脫氧核糖核酸（DNA）的復(fù)制，從而可以了解肝臟再生的細(xì)胞來源。利用嚙齒類動(dòng)物模型，研究者發(fā)現(xiàn)在肝臟切除后16小時(shí)左右，肝細(xì)胞開始出現(xiàn)DNA的復(fù)制，大約在24～36小時(shí)達(dá)到高峰；當(dāng)再生完成時(shí)，所有肝細(xì)胞發(fā)生了一次或者兩次增殖。基于這些研究，領(lǐng)域內(nèi)普遍認(rèn)為，在肝臟再生過程中，肝細(xì)胞的自我復(fù)制是再生的主要細(xì)胞來源。

在對(duì)肝臟切除再生過程的一系列研究中，利用生物化學(xué)的分離純化和檢測手段，人們還發(fā)現(xiàn)了一系列在再生過程中有誘導(dǎo)生長作用的因子和激素類物質(zhì)，比如上皮細(xì)胞生長因子（EGF）、肝細(xì)胞生長因子（HGF）、甲狀腺素、去甲腎上腺素等。這些因子的單獨(dú)使用，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)都可以看到對(duì)肝細(xì)胞增殖有部分的誘導(dǎo)作用。不過那個(gè)時(shí)代的研究缺乏遺傳學(xué)動(dòng)物模型，因此這些因子體內(nèi)的確切作用機(jī)制，不是非常明朗。有意思的是，對(duì)肝臟再生過程進(jìn)行組織學(xué)分析，可以觀察到不同形態(tài)大小的肝細(xì)胞，而體外培養(yǎng)這些肝細(xì)胞時(shí)，似乎也看到它們的增殖能力不盡相同。也由此提出肝臟內(nèi)不同肝細(xì)胞可能增殖能力不同，對(duì)再生的貢獻(xiàn)大小不同的假說。

尋找肝臟干細(xì)胞

在胚胎發(fā)育中，大家發(fā)現(xiàn)了胚胎肝臟干細(xì)胞的存在，其發(fā)育來源于胚胎早期形成的內(nèi)胚層組織。在肝臟形成過程，這些干細(xì)胞可以進(jìn)一步分化為兩類不同的上皮細(xì)胞——肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞。20世紀(jì)90年代，隨著實(shí)體組織中成體干細(xì)胞概念的逐步形成，肝臟再生領(lǐng)域中也有人提出成體肝臟中是否存在肝臟干細(xì)胞。這些成體肝臟中的干細(xì)胞可以在損傷后貢獻(xiàn)到肝細(xì)胞的再生，以及膽管細(xì)胞的再生。因此，研究者們參照其他器官，特別是血液組織造血干細(xì)胞的研究方案，利用在細(xì)胞表面特異表達(dá)的分子，分離純化可能的成體肝臟干細(xì)胞。這個(gè)研究的過程參考了胚胎發(fā)育時(shí)期肝臟干細(xì)胞的表面特異分子。

最后的結(jié)果是，大家發(fā)現(xiàn)了近十種不同的表面分子，這些表面特異分子可以標(biāo)記互相間重疊程度或大或小的若干類群細(xì)胞。利用譜系追蹤技術(shù)，不同實(shí)驗(yàn)室在各自研究的損傷模型中，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞似乎都能貢獻(xiàn)到肝臟再生中去。利用肝細(xì)胞移植技術(shù)，大家還發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞多多少少也都可以在移植后再生。但是，很難想象成熟肝臟中存在這么復(fù)雜的干細(xì)胞體系。因此，成體肝臟干細(xì)胞是否存在，讓研究人員產(chǎn)生了極大的困惑。

另一方面，在肝切除模型中，早期有人對(duì)肝臟嘗試了連續(xù)的切除和再生研究。發(fā)現(xiàn)可以進(jìn)行多達(dá)12次連續(xù)的肝臟切除和再生。在20世紀(jì)90年代，大家也逐步建立了肝細(xì)胞移植的模型，基本思路是構(gòu)建一些功能缺陷肝臟動(dòng)物模型，移植野生型動(dòng)物的肝細(xì)胞后，這些野生型的肝細(xì)胞可以在肝臟中定植和擴(kuò)增。利用這些肝細(xì)胞移植模型，大家發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞可以長期連續(xù)移植。通過相應(yīng)的計(jì)算，估計(jì)肝細(xì)胞可以擴(kuò)增30多次，也就是大約10億倍左右?；谶@些發(fā)現(xiàn)，有人提出了肝細(xì)胞可能并不是終末分化細(xì)胞，其本身是否就是單能干細(xì)胞（unipotent stem cell）的假說?；谶@個(gè)假說，一直尋找的肝臟干細(xì)胞可能就是成熟肝細(xì)胞；不過，這個(gè)假說也指出，這樣的單能肝臟干細(xì)胞很可能就無法貢獻(xiàn)到膽管細(xì)胞了。

盡管成體肝臟干細(xì)胞的尋找并不順利，或者說讓人非常有挫敗感，但在對(duì)肝臟干細(xì)胞的探索過程中，還是涌現(xiàn)了大量的新數(shù)據(jù)和新假說。比如，利用移植技術(shù)，基本否定了成體組織內(nèi)存在多潛能干細(xì)胞的概念；也否定了血液細(xì)胞可以轉(zhuǎn)換為肝細(xì)胞的假說。另一方面，利用這些新發(fā)現(xiàn)和新技術(shù)，推動(dòng)了一些成果的臨床轉(zhuǎn)化研究。比如，研究者們發(fā)現(xiàn)了胚胎肝干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，提出了肝細(xì)胞移植治療的概念，建立了肝細(xì)胞移植的動(dòng)物模型。此外，也開始初步嘗試生物人工肝的大動(dòng)物和臨床研究。但是，由于肝細(xì)胞培養(yǎng)和分化的技術(shù)難題，而臨床治療所需的細(xì)胞數(shù)量極大，因此，這些技術(shù)都沒有真正實(shí)現(xiàn)臨床的治療應(yīng)用。

肝細(xì)胞屬性轉(zhuǎn)換研究的興起

21世紀(jì)以來，隨著細(xì)胞譜系遺傳標(biāo)記技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，研究者們可以更為精準(zhǔn)地跟蹤細(xì)胞在體內(nèi)的譜系變化。到2010年前后，利用了一系列高度復(fù)雜和精準(zhǔn)的遺傳標(biāo)記方法，若干個(gè)實(shí)驗(yàn)室陸續(xù)確認(rèn)再生過程中的肝細(xì)胞都是來自原有的肝細(xì)胞，從而基本否定了肝臟干細(xì)胞的存在。在同一個(gè)時(shí)期內(nèi)，隨著獲諾貝爾獎(jiǎng)的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPSC）技術(shù)的建立，以及中國、美國等學(xué)者成功實(shí)現(xiàn)了將成纖維細(xì)胞體外轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌愋凸δ芗?xì)胞，不同細(xì)胞屬性間可以發(fā)生轉(zhuǎn)換（包括細(xì)胞去分化和細(xì)胞轉(zhuǎn)分化）這個(gè)概念得到廣泛認(rèn)可。與此同時(shí)，一些關(guān)于體內(nèi)損傷再生過程的細(xì)胞屬性轉(zhuǎn)換的研究也開始出現(xiàn)，主要是在腸道、胰島等上皮組織中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞屬性轉(zhuǎn)換對(duì)組織損傷修復(fù)的作用。

在此背景下，有研究者開始考慮肝臟是否也存在通過細(xì)胞屬性轉(zhuǎn)換方式實(shí)現(xiàn)損傷后的組織再生。因此，利用遺傳標(biāo)記方式，對(duì)損傷后肝臟再生過程進(jìn)行詳細(xì)的研究分析。研究者發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞在某些急性損傷后，的確會(huì)發(fā)生去分化，獲得胚胎肝臟干細(xì)胞的某些特征；并且這些細(xì)胞在損傷后修復(fù)過程中，可以再次分化為肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞。這些經(jīng)由肝細(xì)胞“去分化-再分化”的再生方式可以貢獻(xiàn)到30%以上的肝組織再生。由于這個(gè)去分化過程十分短暫的，因此，用傳統(tǒng)方法無法很好地捕捉到。這也部分解釋了為何很長一段時(shí)間，研究者看到了多種所謂的“肝臟干細(xì)胞”——很可能大家標(biāo)記的細(xì)胞處于去分化過程的不同階段。更為有意思的是，中國和英國的科學(xué)家利用細(xì)胞譜系標(biāo)記技術(shù)率先證明，在肝細(xì)胞增殖受到抑制的條件下，肝細(xì)胞的再生可以由膽管細(xì)胞而來。在嚴(yán)重的長期損傷下，大約50%以上的再生肝細(xì)胞是來自于膽管細(xì)胞。雖然膽管細(xì)胞形成肝細(xì)胞的過程到底是直接轉(zhuǎn)分化，還是去分化后再分化，抑或其本身就具有兼性干細(xì)胞的特質(zhì)，仍然有爭論，但是這個(gè)發(fā)現(xiàn)，給肝臟再生提供了一個(gè)全新的模式。

肝細(xì)胞是實(shí)現(xiàn)細(xì)胞移植治療的關(guān)鍵細(xì)胞。雖然肝細(xì)胞在體內(nèi)具有強(qiáng)大的增殖能力，但是在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，一直到最近幾年都沒有完全解決，這也是造成臨床肝細(xì)胞移植治療遲遲沒有重大進(jìn)展的原因之一。上述這些細(xì)胞屬性轉(zhuǎn)換現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和概念的建立，特別是去分化的概念提示大家，是否可以將分化的肝細(xì)胞先進(jìn)行去分化為肝臟干細(xì)胞后，再實(shí)現(xiàn)體外擴(kuò)增肝細(xì)胞。因此，中國、荷蘭、日本和韓國的學(xué)者利用這一假說，率先克服了成體肝細(xì)胞無法在體外培養(yǎng)擴(kuò)增的技術(shù)難題，實(shí)現(xiàn)了肝細(xì)胞的體外獲得，為肝細(xì)胞移植治療等提供了扎實(shí)的技術(shù)支撐。

從這些研究歷史可以看到于2010年前后，中國學(xué)者開始逐步加入到全球肝臟再生研究的第一梯隊(duì)中，并做出了一系列重要的本土原創(chuàng)貢獻(xiàn)。這完全是因?yàn)殡S著國家經(jīng)濟(jì)實(shí)力的增強(qiáng)，對(duì)科研投入的加大，才能使新一代的本土研究者能夠有機(jī)會(huì)在相關(guān)領(lǐng)域內(nèi)做出中國人的貢獻(xiàn)?？梢灶A(yù)期，我國的科技人員未來會(huì)在各個(gè)前沿基礎(chǔ)和應(yīng)用研究領(lǐng)域獲得更多出色的原創(chuàng)成果，也期待相關(guān)研究成果能夠早日實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化和臨床應(yīng)用的突破，為中國和全世界人民的健康謀福祉。

新技術(shù)促進(jìn)肝臟再生研究

從上述對(duì)肝臟再生研究的回顧，我們大致可以看到知識(shí)發(fā)展的某些規(guī)律性。新發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)生，常常伴隨一些無法解釋的現(xiàn)象，一些未被解答的科學(xué)問題。利用時(shí)代發(fā)展中全新的技術(shù)方法，結(jié)合本領(lǐng)域或者其他領(lǐng)域一些尚未被完全證實(shí)的新概念范式，逐步產(chǎn)生了一些新的發(fā)現(xiàn)。而新的發(fā)現(xiàn)必然帶來新的認(rèn)知、新的突破和新的應(yīng)用（這些新認(rèn)知、新突破、新應(yīng)用，有些是可以預(yù)測的，有些是無法預(yù)測的），同時(shí)也帶來了一些新的困惑、新的不解，這又推動(dòng)研究者繼續(xù)探索新的方向和領(lǐng)域，肝臟再生也是如此。

肝小葉是肝臟的基本功能結(jié)構(gòu)單元，長期以來，大家知道從匯管區(qū)到中央靜脈，肝細(xì)胞的代謝表達(dá)譜不同。在肝細(xì)胞移植過程不同區(qū)域肝細(xì)胞移植后，可以形成所有的肝細(xì)胞，因此這種不同被認(rèn)為是微環(huán)境誘導(dǎo)的差異，并沒有聯(lián)系到肝臟再生中去。隨著譜系追蹤技術(shù)不斷深入，研究者們可以更好地標(biāo)記不同區(qū)域的肝細(xì)胞。這時(shí)，大家發(fā)現(xiàn)肝臟不同部位的肝細(xì)胞似乎貢獻(xiàn)到再生中的能力不同。近來，隨著單細(xì)胞測序技術(shù)的引入，帶來了大量的數(shù)據(jù)，從而使得數(shù)據(jù)源頭驅(qū)動(dòng)、結(jié)合生物學(xué)機(jī)制研究的范式，也在肝臟再生研究領(lǐng)域成為一種新的研究方法和體系。2015年前后，單細(xì)胞表達(dá)譜測序技術(shù)開始逐步成為實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)技術(shù)。與此同時(shí)，有不少研究者對(duì)肝臟不同部位的肝細(xì)胞，不同損傷狀態(tài)下的肝細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞測序，發(fā)現(xiàn)的確肝臟這個(gè)表面上看起來均質(zhì)的組織，實(shí)質(zhì)上在不同組織區(qū)域，存在著很大的表達(dá)差異。因此，這就對(duì)肝臟的再生提出了全新的挑戰(zhàn)，這些空間位置不同，表達(dá)譜不同的細(xì)胞，在再生中是如何作用，是否都發(fā)生一樣的變化？在再生過程中，又是如何重新形成的？在特定病理?xiàng)l件下，如何重塑微環(huán)境？如何合理精準(zhǔn)地動(dòng)員這些細(xì)胞貢獻(xiàn)到再生，并且避免肝臟疤痕（纖維化）的形成？對(duì)這些問題的回答和了解，很可能把我們對(duì)肝臟再生帶入到一個(gè)全新的領(lǐng)域，非常值得期待。

肝臟再生的普羅米修斯之火

回溯過去半個(gè)多世紀(jì)肝臟再生的歷史，在探索未知的前沿，是一條充滿荊棘的光榮之路，艱辛曲折然而意義深遠(yuǎn)。我們對(duì)自然的認(rèn)識(shí)很大程度上是受限于我們現(xiàn)有的技術(shù)和工具；技術(shù)和工具的局限性，使得很多探索無法深入并企及細(xì)節(jié)，相關(guān)的結(jié)論和由此構(gòu)建的理論框架也就必然會(huì)在某些方面存在困難?？蚣苄岳碚摰臉?gòu)建一方面指導(dǎo)了我們更高效地對(duì)未知的探索和理解，另一方面也常常會(huì)使我們對(duì)新的認(rèn)知造成局限。所以那些全新的技術(shù)體系，那些反復(fù)出現(xiàn)、無法解釋的現(xiàn)象，不管是新的還是舊的，成為那些活躍在第一線的先鋒們的關(guān)注點(diǎn)。只有那些勇于打破成規(guī)的行動(dòng)者和真正深刻的思考者，如同普羅米修斯給人類帶來火種，才會(huì)給整個(gè)領(lǐng)域一次又一次地帶來全新的觀察和顛覆性的理論體系。