柑橘果醋發(fā)酵條件的優(yōu)化及其成分分析

楊馨悅，楊宇馳，周秀娟，薛桂新*

(1.延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133002；2.吉林省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院，長(zhǎng)春 130012)

柑橘常溫貯藏期較短，季節(jié)性收獲時(shí)易造成大量堆積腐爛現(xiàn)象，影響果農(nóng)的經(jīng)濟(jì)收入以及當(dāng)?shù)氐慕?jīng)濟(jì)發(fā)展。柑橘含汁量較高，適合加工成飲料、果酒和果醋等液體產(chǎn)品。柑橘適合加工成飲料，但產(chǎn)品單一，可以加工成果酒和果醋，但柑橘中含檸檬苦素等會(huì)導(dǎo)致果酒味苦，若先加工成果酒再加工成果醋，在醋酸發(fā)酵過(guò)程中檸檬苦素等會(huì)逐漸減少或消失，果醋品質(zhì)較好。因此，將柑橘加工成果醋既能增加農(nóng)民收入，緩解滯銷，降低損失，又能增加果醋新品種，提高附加值，這對(duì)提高柑橘的綜合利用、推動(dòng)果醋的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展都具有重要意義。

近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)葡萄、蘋(píng)果、桑葚、火龍果、山棗果醋及其果醋飲料進(jìn)行了研究，但對(duì)柑橘果醋的研究較少[1-10]，對(duì)柑橘果醋發(fā)酵基質(zhì)優(yōu)化條件及其主要成分的分析報(bào)道較少[11-13]。

本試驗(yàn)采用液態(tài)表面發(fā)酵法對(duì)柑橘果醋發(fā)酵基質(zhì)中的酒精度、營(yíng)養(yǎng)鹽、底酸和發(fā)酵溫度進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，并對(duì)優(yōu)化后柑橘果醋的主要成分進(jìn)行了分析，為柑橘果醋的釀造技術(shù)和品質(zhì)的研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

柑橘：市售；白砂糖：GB 317-2006，廣東大華糖業(yè)有限公司生產(chǎn)；酵母菌：富門(mén)伯恩酵母(Fermol Rouge Bayanus)，品種為Saccharomycescerevisiaeph. v. bayanus，購(gòu)自意大利AEB公司；果膠酶：德國(guó)三顆星食品物料公司；醋酸菌：滬釀1.01號(hào)醋酸菌種，上海釀造科學(xué)研究所。

1.2 試劑與藥品

酵母浸膏(BR)、葡萄糖(AR)、氫氧化鈉(AR)、酚酞指示劑(AR)、亞硝酸鈉(AR)、硝酸鋁(AR)、乙醇(AR)、營(yíng)養(yǎng)鹽(食品級(jí))：湖北省宜昌市安琪酵母股份有限公司。

磷酸、甲醇、乙腈、乙酸乙酯：色譜純；DL-酒石酸、L-蘋(píng)果酸、檸檬酸、L-乳酸、沒(méi)食子酸、(+)-兒茶素、表兒茶素、咖啡酸、綠原酸、阿魏酸、對(duì)香豆酸、蘆丁、白藜蘆醇、槲皮素：以上標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司。

1.3 主要儀器與設(shè)備

HH.S型電熱恒溫水浴鍋 江蘇省醫(yī)療機(jī)械廠；HH-B11-600型電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市津北真空儀器廠；YH01L310型立式壓力蒸汽鍋 上海醫(yī)用核子儀器廠；BSA124S-CW型電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ型凈化工作臺(tái) 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；UV-7504型紫外分光光度計(jì) 欣茂儀器有限公司；TDZ5-WS型高速離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；LC-2010A型高效液相色譜儀 日本島津公司。

1.4 柑橘果醋工藝流程及操作要點(diǎn)

1.4.1 工藝流程

柑橘→去皮→打漿→調(diào)整糖度→加入活化酵母菌↓酒精發(fā)酵→醋酸菌種子液培養(yǎng)↓柑橘果醋發(fā)酵基質(zhì)配制→醋酸發(fā)酵→柑橘果醋→殺菌→常溫貯存。

1.4.2 酒精發(fā)酵

柑橘去皮打漿，加入適量果膠酶，混勻。待酶解完成后，調(diào)整果漿糖度，取柑橘重量0.02%的酵母，活化后加入柑橘果漿內(nèi)攪拌均勻。在25 ℃左右室溫下發(fā)酵，當(dāng)酒精度為12%左右時(shí)，發(fā)酵結(jié)束，濾出酒液備用。

1.4.3 醋酸菌種子液制備

取1%酵母浸膏、1%葡萄糖放入1000 mL三角瓶中，經(jīng)121 ℃滅菌20 min，取出冷卻。再加入4%的食用酒精混勻，在無(wú)菌室內(nèi)用接種環(huán)挑取斜面醋酸菌接種于液體培養(yǎng)基中，搖勻放入30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)總酸含量為2%左右時(shí)，即可作為種子液使用。

1.4.4 柑橘果醋發(fā)酵基質(zhì)配制

柑橘果醋發(fā)酵基質(zhì)由柑橘果酒、底酸、營(yíng)養(yǎng)鹽和醋酸菌種子液組成，按照單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行配制，發(fā)酵基質(zhì)占容器體積的10%。

1.5 柑橘果醋發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)

采用柑橘果醋發(fā)酵工藝，分別對(duì)酒精度(5%、6%、7%、8%)、營(yíng)養(yǎng)鹽含量(0.00%、0.05%、0.10%、0.15%)、底酸含量(0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%)和發(fā)酵溫度(30，32，34 ℃)做單因素試驗(yàn)，以柑橘果醋總酸含量為主要考察指標(biāo)，酒精轉(zhuǎn)化率和發(fā)酵時(shí)間為參考指標(biāo)。

1.6 柑橘果醋發(fā)酵工藝正交優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，酒精度為6%，對(duì)營(yíng)養(yǎng)鹽含量、底酸含量和發(fā)酵溫度進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)。試驗(yàn)按L9(34)正交表設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1。

表1 柑橘果醋發(fā)酵條件優(yōu)化正交設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal design optimization of fermentation conditions for citrus fruit vinegar

1.7 柑橘果醋總酸含量的分析

參照GB/T 12456-2008《食品中總酸的測(cè)定》，以乙酸計(jì)[14]。

1.8 柑橘果醋的成分分析

以柑橘果汁為參比，對(duì)柑橘果醋中的主要成分進(jìn)行分析。

1.8.1 總黃酮的分析

根據(jù)王曉林等[15]的方法，略有改動(dòng)。樣品處理：取殺菌冷卻后的柑橘果醋于3000 r/min離心10 min后備用。

取樣液1 mL，加入0.5 mL 5%亞硝酸鈉搖勻，放置6 min。加入0.5 mL 10%硝酸鋁搖勻，放置6 min，加入5 mL 4%氫氧化鈉，以60%乙醇定容至10 mL，搖勻，放置15 min，以3500 r/min離心10 min，取上清液倒入比色皿中，以蒸餾水為參比，在509 nm下測(cè)定吸光度。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總黃酮含量。

1.8.2 有機(jī)酸的分析

參考GB 5009.157-2016《食品有機(jī)酸的測(cè)定》[16]，略有改動(dòng)。樣品處理與1.8.1一致。取樣液用流動(dòng)相稀釋一定倍數(shù)后，過(guò)0.45 μm濾膜后進(jìn)樣分析。

色譜條件：采用C18柱，流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液∶甲醇為97.5∶2.5(V/V)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm；柱溫40 ℃；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

1.8.3 總酚的分析

總酚采用福林酚法分析[17]，以沒(méi)食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行定量，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算總酚含量。

1.8.4 單體酚的分析

參照孫翔宇等[18]的方法，略有改動(dòng)。樣品處理與1.8.1一致。取樣液10 mL，以2倍體積(20 mL)的乙酸乙酯萃取3次，合并有機(jī)相，在35 ℃下減壓濃縮至干，以5 mL甲醇復(fù)溶，過(guò)0.45 μm濾膜后進(jìn)樣分析。

色譜條件：采用 C18柱；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 L，柱溫30 ℃；采用二元梯度洗脫；流動(dòng)相A：乙腈-冰乙酸(98∶2，V/V)，流動(dòng)相 B：水-冰乙酸(98∶2，V/V)。梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 梯度洗脫程序Table 2 The gradient elution procedure

續(xù) 表

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘果醋發(fā)酵工藝單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同酒精度對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

圖1 不同酒精度對(duì)柑橘果醋發(fā)酵的影響Fig.1 The effect of different alcohol content on fermentation of citrus fruit vinegar

由圖1可知，發(fā)酵基質(zhì)中酒精度不同，總酸含量、酒精轉(zhuǎn)化率均不同。隨著酒精度的增加，最高總酸含量分別達(dá)到5.037%、5.971%、6.464%、6.474%，且酒精度為7%和8%與其他兩組均具有顯著性差異(P<0.05)，這是因?yàn)榫凭谴姿岚l(fā)酵的底物，在一定范圍內(nèi)底物充足，醋酸含量高。但酒精轉(zhuǎn)化率卻隨著酒精度增加而降低，當(dāng)酒精度為5%、6%、7%、8%時(shí)，其酒精轉(zhuǎn)化率分別為97.01%、95.70%、88.68%、77.26%，均存在顯著性差異(P<0.05)。本試驗(yàn)以釀制一級(jí)醋(醋酸含量>5%)為目標(biāo)，因此，從實(shí)際生產(chǎn)等綜合因素方面考慮，選擇醋酸發(fā)酵的酒精度為6%。

2.1.2 不同營(yíng)養(yǎng)鹽含量對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

營(yíng)養(yǎng)鹽中含有醋酸菌生長(zhǎng)所必需的鹽類及生長(zhǎng)因子，具有強(qiáng)化醋酸菌生長(zhǎng)與代謝的作用，能有效地縮短發(fā)酵周期，提高醋酸產(chǎn)量，改善醋酸品質(zhì)及降低生產(chǎn)綜合成本[19]。

圖2 不同營(yíng)養(yǎng)鹽含量對(duì)柑橘果醋發(fā)酵的影響Fig.2 The effect of different nutritive salt content on fermentation of citrus fruit vinegar

由圖2可知，當(dāng)營(yíng)養(yǎng)鹽含量為0.10%和0.15%時(shí)，柑橘果醋總酸含量無(wú)顯著性差異，但均顯著高于對(duì)照組和0.05%的處理組。當(dāng)營(yíng)養(yǎng)鹽含量為0.10%和0.15%時(shí)，其酒精轉(zhuǎn)化率為94.72%和94.32%，不存在顯著性差異(P>0.05)；而對(duì)照組和0.05%處理組的酒精轉(zhuǎn)化率僅能達(dá)到88.42%和91.69%。因此，從生產(chǎn)成本等綜合因素方面考慮，選擇營(yíng)養(yǎng)鹽0.10%為最佳含量。

2.1.3 不同底酸含量對(duì)醋酸發(fā)酵的影響

圖3 不同底酸含量對(duì)柑橘果醋發(fā)酵的影響Fig.3 The effect of different base acid content on fermentation of citrus fruit vinegar

由圖3可知，當(dāng)?shù)姿岷糠謩e為0.6%0.8%、1.0%、1.2%時(shí)，柑橘果醋總酸最高含量無(wú)顯著差異，但均顯著高于1.4%時(shí)。在底酸含量分別為0.6%、0.8%、1.0%、1.2%時(shí)，柑橘果醋的酒精轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到93.11%、93.11%、95.13%、92.09%，顯著高于(P<0.05)底酸含量1.4%時(shí)的酒精轉(zhuǎn)化率88.25%。由此說(shuō)明，柑橘果醋發(fā)酵基質(zhì)中的底酸含量不宜超過(guò)1.2%。

2.1.4 不同發(fā)酵溫度對(duì)醋酸含量的影響

圖4 不同發(fā)酵溫度對(duì)柑橘果醋發(fā)酵的影響Fig.4 The effect of different fermentation temperatures on fermentation of citrus fruit vinegar

由圖4可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為30，32，34 ℃時(shí)，3個(gè)發(fā)酵溫度最大總酸含量之間無(wú)顯著性差異，其酒精轉(zhuǎn)化率分別為95.21%、92.33%、95.61%，也不存在顯著性差異(P>0.05)。因此，在溫度變化范圍較小的情況下，對(duì)柑橘果醋的總酸含量和酒精轉(zhuǎn)化率影響較小。

2.2 柑橘果醋發(fā)酵條件正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

表3 柑橘果醋正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of citrus fruit vinegar

由表3可知，5號(hào)試驗(yàn)柑橘果醋總酸含量最高，為6.167%；酒精轉(zhuǎn)化率最高，為98.83%；發(fā)酵時(shí)間為84 h，即當(dāng)營(yíng)養(yǎng)鹽含量為0.10%、底酸含量為0.8%、發(fā)酵溫度為34 ℃的條件下柑橘果醋最佳優(yōu)化組合為A2B2C3。但分析結(jié)果最佳優(yōu)化組合為A2B2C2，分析結(jié)果與試驗(yàn)結(jié)果不同，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Verification test results

分析驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，組合A2B2C3的總酸含量和酒精轉(zhuǎn)化率均高于組合A2B2C2，且發(fā)酵時(shí)間較組合A2B2C2短12 h。因此，組合A2B2C3為最佳優(yōu)化組合，即營(yíng)養(yǎng)鹽含量為0.10%，底酸含量為0.8%，發(fā)酵溫度為34 ℃時(shí)總酸含量為6.167%。

通過(guò)極差分析可以看出，RA>RC>RB，說(shuō)明營(yíng)養(yǎng)鹽含量對(duì)柑橘果醋總酸含量影響最大(RA=0.261)，底酸含量對(duì)柑橘果醋總酸含量影響最小。發(fā)酵溫度介于營(yíng)養(yǎng)鹽含量和底酸含量之間。

表5 柑橘果醋總酸含量正交試驗(yàn)方差分析表 Table 5 Variance analysis table of orthogonal test for total acid content of citrus fruit vinegar

對(duì)表3試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析得出表5，營(yíng)養(yǎng)鹽、底酸和發(fā)酵溫度的P值均為0.000(P<0.01)，說(shuō)明3個(gè)因素對(duì)柑橘果醋總酸含量的影響均為極顯著。

2.3 柑橘果醋的主要成分分析

2.3.1 總黃酮含量的分析

圖5 柑橘果醋中的總黃酮含量Fig.5 The content of total flavonoids in citrus fruit vinegar

由圖5可知，柑橘果汁、果醋中的總黃酮含量分別為224.09，85.45 mg/L，果醋中的總黃酮含量顯著低于柑橘汁中的總黃酮含量，這可能是由于柑橘果醋的醋酸發(fā)酵時(shí)間長(zhǎng)、需氧發(fā)酵等使總黃酮含量損失的結(jié)果[20]。

2.3.2 有機(jī)酸含量的分析

圖6 柑橘果醋中的有機(jī)酸含量Fig.6 The content of organic acids in citrus fruit vinegar

由圖6可知，柑橘果醋和柑橘汁中不同種類有機(jī)酸的含量均具有顯著性差異(P<0.05)。其中，柑橘汁中的有機(jī)酸含量：檸檬酸>蘋(píng)果酸>酒石酸和乳酸。酒石酸和乳酸含量無(wú)顯著性差異(P>0.05)。柑橘果醋中的有機(jī)酸含量：乳酸>檸檬酸>蘋(píng)果酸>酒石酸，其中乳酸含量遠(yuǎn)高于其他3種有機(jī)酸，其他3種有機(jī)酸均具有顯著性差異(P<0.05)。

有學(xué)者研究表明，醋酸菌在果醋發(fā)酵過(guò)程中，代謝消耗蘋(píng)果酸、檸檬酸而產(chǎn)生和積累乳酸[21]，產(chǎn)生的乳酸可以緩沖乙酸的強(qiáng)烈刺激性。同時(shí)，醋酸菌發(fā)酵過(guò)程中蘋(píng)果酸和檸檬酸的降低，會(huì)減少尖酸刺激感和增加醋的澄清度。

2.3.3 總酚含量的分析

圖7 柑橘果醋中的總酚含量Fig.7 The content of total phenols in citrus fruit vinegar

由圖7可知，柑橘果醋中的總酚含量顯著低于柑橘汁中(P<0.05)，這是因?yàn)榇姿峋鷮儆谛柩跣晕⑸铮谡麄€(gè)醋酸發(fā)酵過(guò)程中需提供足夠的氧氣，發(fā)酵液中酚類物質(zhì)被破壞，導(dǎo)致其含量降低[22]。

2.3.4 單體酚含量的分析

圖8 柑橘果醋中的單體酚含量Fig.8 The content of monomeric phenols in citrus fruit vinegar

由圖8可知，柑橘果醋中，槲皮素、表兒茶素、兒茶素、綠原酸含量相對(duì)較高，其他酚類物質(zhì)含量較低。柑橘汁中10種單體酚的含量存在顯著性差異，槲皮素、表兒茶素、兒茶素和阿魏酸的含量相對(duì)較高，其他酚類物質(zhì)含量較低。同一種單體酚在柑橘汁和柑橘醋中含量各不相同。

3 結(jié)論

采用液態(tài)表面發(fā)酵法發(fā)酵的柑橘果醋在酒精度為6%的條件下，營(yíng)養(yǎng)鹽含量0.10%，底酸含量0.8%，發(fā)酵溫度34 ℃為醋酸發(fā)酵最佳組合，在此條件下釀制的柑橘果醋總酸含量可達(dá)到6.167%。

柑橘果醋在檢測(cè)的4種有機(jī)酸中，乳酸含量遠(yuǎn)高于檸檬酸、蘋(píng)果酸、酒石酸；在檢測(cè)的10種單體酚中，槲皮素、表兒茶素、兒茶素含量高于其他單體酚；柑橘果醋總酚和總黃酮含量均低于柑橘果汁。