雙酶法提取大蒜多糖工藝優(yōu)化及其體外抗氧化活性研究

董玉瑋，苗敬芝*，李勇

(1.徐州工程學院 食品與生物工程學院，江蘇 徐州 221018；2.江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設實驗室，江蘇 徐州 221018)

大蒜為多年生草本、百合科蔥屬植物，在我國種植廣泛[1]。大蒜中含有多種生物活性物質(zhì)，主要有多糖、氨基酸、維生素、微量元素等，因而對人體具有抗氧化、防衰老、抗病毒、抗腫瘤、增強免疫力等多種生理功能[2,3]。大蒜多糖是其主要的活性成分之一，能增強T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨細胞的活力，具有保護肝臟、抗菌消炎、降血糖、降血脂、防止動脈粥樣硬化、調(diào)節(jié)機體免疫力等功效，在保健食品和醫(yī)藥領域有著廣闊的開發(fā)前景[4,5]。

大蒜多糖常用的提取方法有熱水提取法、微波提取法、超聲波提取法、酸堿提取法等[6-9]。本試驗以大蒜為原料，采用雙酶法提取大蒜多糖，利用酶具有較高的選擇性，能高效溫和地促使細胞壁裂解，促進多糖向溶液中浸出，所得產(chǎn)物性質(zhì)穩(wěn)定，活性高等特點[10,11]，通過單因素試驗和響應曲面法優(yōu)化大蒜多糖的提取工藝條件，探討大蒜多糖的體外抗氧化活性，并與VC對照，為大蒜產(chǎn)品的深加工提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大蒜：徐州市大韓農(nóng)貿(mào)市場。

濃硫酸、苯酚、硫酸亞鐵、水楊酸、DPPH、鄰苯三酚、95%乙醇等均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

SENCO旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；DHG-9075電熱鼓風干燥箱 上?；厶﹥x器制造有限公司；723G可見分光光度計 上海分析儀器有限公司；TDL-6低速大容量離心機 金壇晨陽電子儀器廠；TU-1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 雙酶法提取大蒜多糖工藝流程

大蒜→去皮、清洗→切片→干燥→粉碎、過篩→稱取一定量大蒜粉→加入纖維素酶和果膠酶→按一定料液比加入檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH→酶解→滅酶→離心→上清液→苯酚-硫酸法測多糖含量。

1.3.2 單因素試驗

1.3.2.1 纖維素酶添加量對大蒜多糖得率的影響

酶解溫度50 ℃，料液比1∶25，果膠酶2.0%，探討纖維素酶添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)對大蒜多糖得率的影響。

1.3.2.2 果膠酶添加量對大蒜多糖得率的影響

酶解溫度50 ℃，料液比1∶25，纖維素酶2.0%，探討果膠酶添加量(0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)對大蒜多糖得率的影響。

1.3.2.3 酶解時間對大蒜多糖得率的影響

酶解溫度50 ℃，料液比1∶25，纖維素酶2.0%，果膠酶2.0%，探討酶解時間(120，140，160，180，200 min)對多糖得率的影響。

1.3.2.4 酶解溫度對大蒜多糖得率的影響

料液比1∶25，纖維素酶添加量2.0%，果膠酶添加量2.0%，探討酶解溫度(35，40，45，50，55 ℃)對多糖得率的影響。

1.3.3 響應曲面法優(yōu)化試驗設計

在單因素試驗的基礎上，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理[12,13]，采用四因素三水平的響應曲面分析法，試驗因素水平設計見表1。

表1 響應曲面因素水平表Table 1 The factors and levels of response surface

1.3.4 大蒜粗多糖的制備

按優(yōu)化方案提取大蒜多糖，離心分離，上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮至原體積的1/3，按體積比4∶1加入95%乙醇純沉，經(jīng)4000 r/min離心20 min，真空冷凍干燥28 h，得大蒜粗多糖。

1.3.5 大蒜多糖體外抗氧化活性試驗

1.3.5.1 大蒜多糖對O2-·自由基清除率的測定[14]

分別取濃度為0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90 mg/L多糖溶液各2.00 mL，依次加入3.0 mL 0.05 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 8.2)于試管中，置于25 ℃水浴預熱20 min，加入2 mL 2.5 mmol/L鄰苯三酚溶液，充分混勻，25 ℃反應5 min，加入2 mL 8%的鹽酸溶液終止反應。以蒸餾水作空白試驗，以相同質(zhì)量濃度的VC溶液作對比，在325 nm處測定吸光度。根據(jù)式(1)計算不同濃度的多糖溶液對O2-·的清除率。

清除率(P,%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

式(1)

式中：A1為樣品的吸光度值，A2為對照的吸光度值，A0為空白品的吸光度值。

1.3.5.2 大蒜多糖對 ·OH自由基清除率的測定

分別取濃度為0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90 mg/L多糖溶液各2.00 mL，依次向試管中加入1 mL Fe2+(9 mmol/L)、1 mL 水楊酸-乙醇(9 mmol/L)、1 mL H2O2(8.8 mmol/L)，在510 nm波長處測吸光度，以1 mL蒸餾水作空白，以相同質(zhì)量濃度的VC溶液作對比。根據(jù)式(2)計算不同濃度的多糖溶液對·OH的清除率。

清除率(P,%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

式(2)

式中：A1為樣品的吸光度值，A2為對照的吸光度值，A0為空白品的吸光度值。

1.3.5.3 大蒜多糖對DPPH自由基清除率的測定[15]

分別取濃度為0.10，0.20，0.30，0.40，0.50，0.60，0.70，0.80，0.90 mg/L多糖溶液各2.00 mL，依次加入個加入2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液中，25 ℃反應25 min后，在517 nm處測定吸光度。以蒸餾水作空白，以相同質(zhì)量濃度的VC溶液作對比，根據(jù)式(3)計算不同濃度的樣品溶液對DPPH的清除率。

清除率(P,%)=[1-(A1-A2)/A0]×100%。

式(3)

式中：A1為樣品的吸光度值，A2為對照的吸光度值，A0為空白品的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗條件選擇

2.1.1 纖維素酶添加量對大蒜多糖得率的影響

圖1 纖維素酶添加量對大蒜多糖得率的影響Fig.1 Effect of cellulase additive amount on the yield of garlic polysaccharides

由圖1可知，纖維素酶添加量在0.5%～2.0%之間，大蒜多糖得率逐漸上升，在該范圍內(nèi)酶添加量越多，酶解效率越高，大蒜多糖越易從裂解細胞中溶出。添加量為2.0%時，多糖得率最高，為28.96%；酶量增至2.5%時，多糖得率下降，可能是酶濃度較高，底物濃度相對較小，酶分子過飽和，部分酶分子不能與底物結(jié)合，降低了酶解效率。因此，纖維素酶最佳添加量為2.0%。

2.1.2 果膠酶添加量對大蒜多糖得率的影響

圖2 果膠酶添加量對大蒜多糖得率的影響Fig.2 Effect of pectinase additive amount on the yield of garlic polysaccharides

由圖2可知，果膠酶添加量在0.5%～2.0%之間，大蒜多糖得率逐漸增加；果膠酶添加量為2.0%時，大蒜多糖得率最高，為28.84%，這時可能酶和底物濃度最適合，酶解效率最高，有利于多糖的溶出。因此，果膠酶最適添加量為2.0%。

2.1.3 酶解時間對大蒜多糖得率的影響

圖3 酶解時間對大蒜多糖得率的影響Fig.3 Effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of garlic polysaccharides

由圖3可知，隨著酶解時間的增加，大蒜多糖得率呈現(xiàn)先增后降的趨勢，160 min時多糖得率最高，為32.47%，隨后下降，可能是隨著時間的延長，多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化而降解。因此，最適宜的酶解時間為160 min。

2.1.4 酶解溫度對大蒜多糖得率的影響

圖4 酶解溫度對大蒜多糖得率的影響Fig.4 Effect of enzymatic hydrolysis temperature on the yield of garlic polysaccharides

由圖4可知，溫度在35～50 ℃之間，大蒜多糖得率逐漸上升，在適宜的溫度范圍內(nèi)，升高溫度，酶解效率提高，促進多糖從裂解的細胞中溶出，50 ℃時多糖得率最高，為30.47%，隨后下降，溫度過高，酶的活性受到抑制而失活。因此，最適宜的酶解溫度為50 ℃。

2.2 響應曲面法優(yōu)化大蒜多糖的提取工藝

2.2.1 模型的建立與顯著性檢驗

采用Box-Behnken試驗，以纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解時間、酶解溫度為變量，以大蒜多糖得率為響應值，以-1，0，1分別代表變量的水平，試驗設計與結(jié)果見表2。

表2 響應曲面試驗設計及結(jié)果Table 2 Results of response surface test design

續(xù) 表

用Design-Expert 8.0軟件對表2中的數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，得到大蒜多糖得率對纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解時間、酶解溫度的回歸模型：

Y=34.81+0.012X1-0.068X2-0.34X3+0.042X4+1.44X1X3+0.093X1X4-0.098X2X3-0.42X2X4-0.29X3X4-2.24X12-2.30X22-2.61X32-1.41X42。

方差分析結(jié)果見表3。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

續(xù) 表3

由表3方差分析結(jié)果可知，模型P<0.01，試驗模型極顯著，失擬項P=0.9731>0.05，失擬項不顯著；模型的決定系數(shù)R2=0.9925，校正決定系數(shù)RAdj2=0.9746，二者數(shù)值較為接近，表明該回歸方程擬合程度良好，用該模型分析和預測大蒜多糖的得率是可靠的。模型F值與對響應值的影響成正比，F(xiàn)值越大，對響應值的影響越大[16]，可見4個因素對大蒜多糖得率的影響大小依次為：酶解時間>纖維素酶添加量>酶解溫度>果膠酶添加量。

2.2.2 響應曲面交互作用分析

a.果膠酶添加量與纖維素酶添加量交互作用對大蒜多糖得率影響的等高線圖和響應曲面圖

b.果膠酶添加量與酶解溫度交互作用對大蒜多糖得率影響的等高線圖和響應曲面圖

c.果膠酶添加量與酶解時間交互作用對大蒜多糖得率影響的等高線圖和響應曲面圖

d.纖維素酶添加量與酶解溫度交互作用對大蒜多糖得率影響的等高線圖和響應曲面圖

f.酶解時間與酶解溫度交互作用對大蒜多糖得率影響的等高線圖和響應曲面圖圖5 因素交互作用對大蒜多糖得率影響的等高線圖和響應曲面圖Fig.5 Contour plots and response surface plots of the effect of factor interaction on the yield of garlic polysaccharides

由響應曲面圖可知，圖5中b，d，e接近橢圓形，故果膠酶添加量與溫度、纖維素酶添加量與溫度、纖維素酶添加量與時間的交互作用對大蒜多糖得率的影響較為顯著；圖5中a，c，f接近圓形，故果膠酶與纖維素酶添加量、果膠酶添加量與時間、酶解時間與溫度的交互作用對大蒜多糖得率的影響不顯著。

2.2.3 條件優(yōu)化與結(jié)果驗證

根據(jù)建立回歸模型對提取工藝進行優(yōu)化，得到最佳提取工藝：纖維素酶添加量1.99%，果膠酶添加量1.96%，溫度49.65 ℃，時間160.48 min，在此提取條件下大蒜多糖的得率理論值為34.88%?？紤]到實際操作過程中的局限性，將提取工藝修改為：纖維素酶2.0%，果膠酶2.0%，溫度50 ℃，時間160 min。采用修正后的條件進行試驗，重復3次取平均值，大蒜多糖實際測定得率為34.76%，與預測值相差0.12%，驗證試驗結(jié)果表明實測值與預測值存在較好的一致性。由此表明該回歸方程有很好的預測能力，可用于大蒜多糖的提取。

2.3 大蒜多糖體外抗氧化活性試驗結(jié)果

2.3.1 大蒜多糖對O2-·自由基的清除能力

圖6 大蒜多糖對O2-·自由基的清除能力Fig.6 The scavenging capacity of garlicpolysaccharides to O2-·

由圖6可知，隨著大蒜多糖濃度的增加，對O2-·自由基的清除能力增大。當大蒜多糖濃度為0.6 mg/mL時，清除率為47.79%，VC清除率為79.65%，之后清除率變化緩慢。在相同質(zhì)量濃度下，VC對O2-·的清除率高于大蒜多糖。

2.3.2 大蒜多糖對·OH自由基的清除能力

圖7 大蒜多糖對·OH的清除能力Fig.7 The scavenging capacity of garlicpolysaccharides to·OH

由圖7可知，隨著大蒜多糖濃度的增加，對·OH自由基的清除能力增大。當大蒜多糖濃度0.7 mg/mL時，清除率為49.84%，VC清除率為89.16%，之后清除率變化緩慢。在相同質(zhì)量濃度下，VC對·OH的清除率高于大蒜多糖。

2.3.3 大蒜多糖對DPPH自由基的清除能力

圖8 大蒜多糖對于DPPH·的清除能力Fig.8 The scavenging capacity of garlicpolysaccharides to DPPH·

由圖8可知，隨著大蒜多糖濃度的增加，對DPPH自由基的清除能力隨之增大。當大蒜濃度為0.7 mg/mL時，大蒜多糖的清除率為56.74%，VC清除率為82.76%，之后清除率變化緩慢。

3 結(jié)論

在單因素試驗的基礎上，對大蒜多糖提取工藝條件進行四因素三水平響應曲面法設計，建立了大蒜多糖得率和各因素之間的數(shù)學模型，通過對回歸模型系數(shù)的顯著性分析，得到各因素之間的相互作用，影響大蒜多糖得率的因素大小順序為：酶解時間>纖維素酶添加量>酶解溫度>果膠酶添加量。大蒜多糖最佳提取工藝參數(shù)為：纖維素酶2.0%，果膠酶2.0%，溫度50 ℃，時間160 min，大蒜多糖實際測定得率為34.76%，與預測值相差0.12%，存在較好的一致性。

大蒜多糖對O2-·、·OH和DPPH自由基均表現(xiàn)出較強的清除能力，且隨其濃度的增加，清除能力增大，呈明顯的量效關(guān)系，相同質(zhì)量濃度大蒜多糖的清除效果低于Vc，但大蒜多糖作為活性成分來源于天然產(chǎn)物。因此，采用雙酶法提取的大蒜多糖具有良好的抗氧化活性，可作為天然綠色的抗氧化劑添加到食品中，具有廣闊的市場前景。