HPLC同時(shí)測(cè)定感冒解毒靈顆粒中8種有效成分的含量

張 娟，杜 武，張秋芳，劉宏明*

（1.淄博市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 淄博 255086；2.淄博市中心醫(yī)院，山東 淄博 255036）

感冒解毒靈顆粒收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第十九冊(cè)，是純中藥制劑，由紫蘇葉、板藍(lán)根、前胡、防風(fēng)、金銀忍冬葉、連翹、麥冬、苦杏仁、羌活、川芎、陳皮、桑白皮、牛蒡子等13味中藥構(gòu)成，功能主治為解表散寒，宣肺止咳，清熱解毒[1]。組方中，板藍(lán)根有抗病毒、降血脂和降血糖等藥理作用，（R,S）-告依春為代表的生物堿已被證明有明顯的抗病毒活性[2]；防風(fēng)主治外感風(fēng)寒、周身疼痛等癥，升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷等色原酮是防風(fēng)主要的活性成分[3]?，F(xiàn)原感冒解毒靈顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)無含量測(cè)定項(xiàng)目，為了更有效地控制感冒解毒靈顆粒質(zhì)量，結(jié)合中國藥典，本文選取了感冒解毒靈顆粒中的6味藥材的8種指標(biāo)性成分作為研究對(duì)象，包括板藍(lán)根中的（R,S）-告依春，防風(fēng)中的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷，金銀忍冬葉中的新綠原酸、綠原酸[4]，連翹中的連翹苷，陳皮中的橙皮苷，牛蒡子中的牛蒡苷，建立了高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)測(cè)定感冒解毒靈顆粒中8種成分含量的方法，為進(jìn)一步完善其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及制劑開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器（美國安捷倫公司）；KS-300E超聲波清洗器（寧波科生儀器廠）；十萬分之一MS205DU電子天平（瑞士梅特勒-托利多）。

1.2 試藥

（R,S）-告依春對(duì)照品（批號(hào)：111753-210706，含量100 %），綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-201817，含量96.8 %），升麻素苷對(duì)照品（批號(hào)：111522-201712，含量96.2 %），5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品（批號(hào)：111523-201610，含量96.1 %），橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110721-201617，含量96.1 %），連翹苷對(duì)照品（批號(hào)：110821-201615，含量94.9 %），牛蒡苷對(duì)照品（批號(hào)110819-201611，含量95.9 %）均購自中國食品藥品檢定研究院；新綠原酸對(duì)照品（ANPEL，批號(hào)：E0420010，含量99.0 %）；感冒解毒靈顆粒（批號(hào)：181214，180902，181114）均為市購；乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：SynergiTMHydro-RP 80?（250 mm×4.6 mm，4 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1 %磷酸的水溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，5 % A；15～30 min，5 % A ～8 % A ；30～58 min，8 % A～12 % A；58～65 min，12 % A ～18 % A；65～75 min，18 %A～25 % A；75～90 min，25 % A～30 %A；90～100 min，30 % A～50 % A）；流速：1.0 ml/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長：（R,S）-告依春245 nm，新綠原酸和綠原酸327 nm，升麻素苷和5-O-甲氧基維斯阿米醇苷254 nm，橙皮苷283 nm，連翹苷和牛蒡苷278 nm；進(jìn)樣量：10 μl。在此色譜條件下，8種成分理論板數(shù)均大于5000，相鄰兩色譜峰分離良好，見圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液 取感冒解毒靈顆粒的內(nèi)容物，研細(xì)，取細(xì)粉約2 g，精密稱定，置入具塞錐形瓶，精密加入甲醇20 ml，密塞，稱定重量，超聲提?。üβ蕿?00 W，頻率為40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，經(jīng)0.45 μm的微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.2 陰性樣品溶液 根據(jù)感冒解毒靈顆粒處方，模擬其制備工藝，制備不含板藍(lán)根、防風(fēng)、金銀忍冬葉、連翹、陳皮、牛蒡子的陰性樣品，依照2.2.1項(xiàng)下方法制備相應(yīng)陰性樣品溶液。

2.2.3 對(duì)照品溶液 精密稱取（R,S）-告依春對(duì)照品10.97 mg，置入100 ml量瓶，加甲醇適量，振搖使溶解，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為（R,S）-告依春對(duì)照品貯備液（0.1097 mg/ml）；同法制成新綠原酸對(duì)照品貯備液（0.4035 mg/ml）、綠原酸對(duì)照品貯備液（0.9835 mg/ml）、升麻素苷對(duì)照品貯備液（1.045 mg/ml）、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品貯備液（0.6400 mg/ml）、連翹苷對(duì)照品貯備液（0.9604 mg/ml）、牛蒡苷對(duì)照品貯備液（1.100 mg/ml）。精密稱取橙皮苷對(duì)照品16.99 mg，置入50 ml量瓶，分別精密加入上述7種對(duì)照品貯備液0.5，2，2，2，1，5，3 ml，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品貯備溶液[含（R,S）-告依春1.097 μg/ml、新綠原酸16.14 μg/ml、綠原酸39.34 μg/ml、升麻素苷41.79 μg/ml、5-O-甲基維斯阿米醇苷12.80 μg/ml、橙皮苷326.5 μg/ml、連翹苷96.04 μg/ml、牛蒡苷綠原酸66.00 μg/ml]。精密量取10 ml混合對(duì)照品貯備液，置入20 ml量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液[含（R,S）-告依春0.5485 μg/ml、新綠原酸8.070 μg/ml、綠原酸19.67 μg/ml、升麻素苷20.89 μg/ml、5-O-甲基維斯阿米醇苷6.4 μg/ml、橙皮苷163.3 μg/ml、連翹苷48.02 μg/ml、牛蒡苷33 μg/ml]。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，見圖1。供試品溶液的色譜圖中，在與對(duì)照品溶液的色譜圖相應(yīng)的位置上，有相同保留時(shí)間的色譜峰，而陰性樣品溶液在此保留時(shí)間處無干擾。

圖1 HPLC色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取混合對(duì)照品溶液1，5，10，15，20 μl及混合對(duì)照品貯備液20 μl，按2.1項(xiàng)下色譜條件依次進(jìn)樣，記錄8個(gè)成分的色譜圖及峰面積。以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見表1。結(jié)果表明8個(gè)成分在表1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 定量限和檢測(cè)限

精密量取混合對(duì)照品溶液1 ml，置入50 ml量瓶，用甲醇稀釋至刻度，搖勻；精密量取適量，用甲醇稀釋制成不同濃度系列的混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以信噪比（S/N）為10時(shí)測(cè)定定量限，信噪比（S/N）為3時(shí)測(cè)定檢測(cè)限，結(jié)果見表1。

2.6 精密度考察

取混合對(duì)照品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄色譜圖。（R,S）-告依春、新綠原酸、綠原酸、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、橙皮苷、連翹苷和牛蒡苷峰面積RSD分別為1.20 %，0.73 %，0.92 %，0.85 %，1.32 %，1.15 %，0.71 %和0.92 %。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

表1 8種成分線性關(guān)系考察結(jié)果及定量限、檢測(cè)限

2.7 重復(fù)性考察

取同批號(hào)樣品（批號(hào)：181214），按2.2.1項(xiàng)下方法，制備6份供試品溶液，分別測(cè)定（R,S）-告依春、新綠原酸、綠原酸、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、橙皮苷、連翹苷和牛蒡苷含量，結(jié)果樣品中平均含量分別為0.06243，0.1832，0.3634，0.4292，0.4507，12.21，3.214和1.836 mg/袋，RSD分別為1.37 %，1.03 %，1.14 %，1.16 %，0.81 %，0.62 %，1.45 %和1.18 %。結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性考察

取按2.2.1項(xiàng)下方法制備的供試品（批號(hào)：181214）溶液，分別于制備后0，4，8，12，18和24 h進(jìn)樣分析，測(cè)得（R,S）-告依春、新綠原酸、綠原酸、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、橙皮苷、連翹苷和牛蒡苷峰面積的RSD分別為1.14 %，0.84 %，0.98 %，1.12 %，1.35 %，0.91 %，1.34 %和1.23 %，結(jié)果表明，供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

取已知含量的感冒解毒靈顆粒樣品（批號(hào)：181214）6份，每份約1 g，精密稱定，置入具塞錐形瓶中，分別精密加入混合對(duì)照品液[（R,S）-告依春、新綠原酸、綠原酸、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、橙皮苷、連翹苷和牛蒡苷8種成分的濃度分別為1.207，3.632，7.868，8.358，8.960，241.0，63.32，385.0 μg/ml]10 ml，再精密加入甲醇10 ml，按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別測(cè)定8種成分含量，計(jì)算回收率。結(jié)果（R,S）-告依春、新綠原酸、綠原酸、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、橙皮苷、連翹苷和牛蒡苷8種成分的平均回收率分別為99.76 %，99.43 %，99.90 %，97.84 %，99.62 %，99.25 %，98.67 %，98.10 %，RSD分別為1.80 %，1.04 %，1.59 %，1.77 %，1.73 %，0.58 %，1.49 %，1.50 %，結(jié)果見表2。

2.10 樣品測(cè)定

取不同生產(chǎn)廠家感冒解毒靈顆粒，按2.2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照上述色譜條件測(cè)定，樣品中（R,S）-告依春、新綠原酸、綠原酸、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、橙皮苷、連翹苷和牛蒡苷的含量測(cè)定結(jié)果見表3。

3 討論

3.1 提取方法的選擇

考察了加熱回流提取法和超聲處理兩種提取方法，提取率無顯著差別，因此選擇操作簡便的超聲提取法。同時(shí)，考察了3個(gè)不同提取時(shí)間（20，30和40 min）對(duì)提取效率的影響，30 min各成分的響應(yīng)高于20 min，而40 min與30 min對(duì)各成分響應(yīng)影響不大，最終確定了提取時(shí)間為30 min[5]。

3.2 波長的選擇

感冒解毒靈顆粒成分復(fù)雜，單一檢測(cè)波長會(huì)出現(xiàn)色譜峰組成單一、峰面積偏小、特征峰數(shù)量少等情況，本文采用DAD 檢測(cè)器進(jìn)行全波長掃描（200～400 nm），分析8種成分的紫外光譜，選擇了8種成分的最佳檢測(cè)波長[6-8]。多波長同時(shí)檢測(cè)提高了檢測(cè)成分的靈敏度，減少了測(cè)定誤差。下一步開展感冒解毒靈顆粒的指紋圖譜研究時(shí)可選用共有峰較多的245 nm作為指紋圖譜的吸收波長。

3.3 流動(dòng)相的選擇

甲醇-水或乙腈-水[6]條件下的色譜峰拖尾，分離度和峰形較差，以乙腈-0.1 %磷酸為流動(dòng)相時(shí)，峰形尖銳。采用等度洗脫[7-8]很難將8種成分與其他色譜峰完全分開，因此本文建立了一種梯度洗脫方法，色譜峰分離效果好，且8種成分均具有較好的穩(wěn)定性、精密度和重復(fù)性，減少了測(cè)定誤差。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

表3 樣品含量結(jié)果/mg·袋-1

綜上，本文建立HPLC法同時(shí)測(cè)定感冒解毒靈顆粒中8種成分的定量分析方法，方法重現(xiàn)性好，專屬性強(qiáng)，可為綜合評(píng)價(jià)感冒解毒靈顆粒提供參考。