QuEChERS-HPLC-MS/MS測(cè)定淡水魚中硝基呋喃代謝物殘留

（浙江優(yōu)科檢測(cè)技術(shù)有限公司，浙江 杭州 311100）

硝基呋喃類藥物主要包括呋喃西林、呋喃唑酮、呋喃妥因和呋喃它酮，是一類人工合成的具有5-硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗生素。因其對(duì)大多數(shù)革蘭陰性菌、革蘭陽性菌和原蟲等病原體均有較強(qiáng)的抑制和滅殺作用[1]，被廣泛用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。有研究發(fā)現(xiàn)，硝基呋喃類化合物是直接致變劑，呋喃唑酮及其代謝物具有較強(qiáng)致突變、致畸和致癌作用[2]，已被大多數(shù)國家禁止用于動(dòng)物性食品[3]。我國農(nóng)業(yè)部于2002 年發(fā)布的第193號(hào)、第235號(hào)公告和2005年發(fā)布的第560號(hào)公告，將硝基呋喃類藥物列為禁用獸藥，嚴(yán)禁用于所有食品動(dòng)物[4]。但硝基呋喃藥物療效好、價(jià)格低廉，為提高水產(chǎn)品的成活率，提高經(jīng)濟(jì)效應(yīng)，一些養(yǎng)殖戶在水產(chǎn)品養(yǎng)殖過程中非法使用硝基呋喃類藥物的現(xiàn)象仍然存在。

硝基呋喃類抗生素不穩(wěn)定、代謝快，在動(dòng)物體內(nèi)的半衰期短，但其代謝物常與組織中的蛋白質(zhì)以結(jié)合態(tài)的形式存在，可長(zhǎng)期、穩(wěn)定地殘留于動(dòng)物體內(nèi)[5]，因此，目前通常以測(cè)定其代謝物的方式來監(jiān)控硝基呋喃類藥物在動(dòng)物體內(nèi)的殘留量。

目前，硝基呋喃代謝物殘留的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法（ELISA）[6]、高效液相色譜（HPLC）[7]、高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）[8]及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）[2-4]。其中，ELISA采用了特異性抗體，具有靈敏度高、經(jīng)濟(jì)、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)，一般適用于篩選檢測(cè)，假陽性率較高。HPLC和HPLC-MS廣泛用于多組分混合物的分離和分析，但動(dòng)物組織基質(zhì)比較復(fù)雜，干擾較多，其準(zhǔn)確性和靈敏度難以達(dá)到痕量分析的要求。HPLC-MS/MS采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（MRM）模式，結(jié)合液相保留時(shí)間及MRM特征離子對(duì)進(jìn)行定性和定量，可減少于保留時(shí)間相同而待測(cè)離子不同所帶來的干擾，同時(shí)提高了檢測(cè)靈敏度，尤其適合于基質(zhì)復(fù)雜樣品的分析，已成為食品中硝基呋喃代謝物殘留檢測(cè)的主流分析方法[9]。

魚肉樣品通常含蛋白質(zhì)和脂肪，基質(zhì)復(fù)雜，通常需要凈化等前處理[10]，目前對(duì)動(dòng)物性食品中硝基呋喃代謝物殘留檢測(cè)的凈化方法主要有正己烷去脂肪[4]及固相萃取法[8]，這兩種方法操作都比較繁瑣，不適于快速檢測(cè)。QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）方法操作簡(jiǎn)便，回收率好，操作效率高，最早應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)，在魚肉中也有關(guān)于氯霉素[11]、磺胺[12]和孔雀石綠[13]的檢測(cè)研究報(bào)道，但在硝基呋喃代謝物檢測(cè)中的應(yīng)用較少。本試驗(yàn)在農(nóng)業(yè)部783 號(hào)公告-1-2006的基礎(chǔ)上[14]，用QuEChERS凈化樣品，進(jìn)一步減少樣品基質(zhì)干擾，采用HPLC-MS/MS檢測(cè)硝基呋喃類藥物代謝物，為淡水魚中硝基呋喃代謝物殘留量的快速檢測(cè)提供參考。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

QSightTMAltus LC 30-QsightTM3Q Mass Spectrometer（高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，美國Perkin Elmer公司）； 3K15臺(tái)式高速離心機(jī)（德國Sigma）；N-EVAP 12管氮?dú)鉂饪s儀（上海安譜）；Vortex Genius 3渦旋振蕩器（德國IKA）。

1.2 試劑

乙酸乙酯，甲酸（色譜純，美國Fisher Chemical）；Bond Elut QuEChERS萃取鹽包（內(nèi)含4 g MgSO4，1 g NaCl，1 g 檸檬酸鈉，0.5 g三水合二檸檬酸二鈉，上海安譜）；15 ml Bond Elut QuEChERS凈化管[內(nèi)含50 mgN-丙基乙二胺固相吸附劑（PSA）和150 mg C18，900 mg Na2SO4，美國Agilent公司]；Al2O3填料，100～300目（上海安譜）；2-硝基苯甲醛（百靈威）；HCl，NaCl，Na2SO4（分析純，廣州化學(xué)試劑有限公司）；5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷基酮（AMOZ），氨基脲（SEM），1-氨基-2-內(nèi)酰脲（AHD），3-氨基-2-惡唑烷基酮（AOZ，北京壇墨質(zhì)檢科技有限公司）。

2 方法

2.1 樣品處理

稱取魚肉樣品4.00 g于50 ml離心管，加0.2 mol/L鹽酸溶液8.00 ml，0.05 mol/L 2-硝基苯甲醛溶液0.15 ml，渦旋混合1 min，37 ℃水浴恒溫震蕩衍生16 h。衍生后的樣品加入0.3 mol/L Na2SO41 ml，用2 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0～7.5，加入10 ml乙酸乙酯，渦旋混勻后加入萃取鹽包，渦旋提取1 min，8000 r/min、4 ℃離心5 min，取6 ml上清，移入QuEChERS凈化管，渦旋1 min后，8000 r/min、4 ℃離心5 min。取5 ml上清，40 ℃下氮吹至干，用20 %甲醇水1.00 ml溶解，過0.22 μm濾膜后供HPLC-MS/MS測(cè)定。

同時(shí)除不加樣品外，按上述步驟處理，做方法空白試驗(yàn)；另稱取樣品后添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述步驟處理樣品，做質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)。

2.2 儀器條件

色譜柱：Agilent Eclipse Plus C18（2.1 mm×150 mm，8 μm），柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μl，流動(dòng)相為2 mmol/L乙酸銨溶液和甲醇，流速0.3 ml/min，梯度洗脫程序見表1。正離子模式，離子化噴霧電壓4500 V，離子源溫度400 ℃，質(zhì)譜接口加熱氣溫度300 ℃，霧化器溫度150 ℃，反吹干燥氣100 ml/min，MRM參數(shù)見表2。

表1 HPLC梯度洗脫程序

表2 硝基呋喃代謝物衍生物質(zhì)譜分析參數(shù)

2.3 結(jié)果計(jì)算

樣品中硝基呋喃代謝物含量按公式X=（Ci×V）/m計(jì)算。其中X為樣品中硝基呋喃代謝物的含量（μg/kg）；Ci為樣品溶液中硝基呋喃代謝物的濃度（ng/ml）；m為樣品質(zhì)量（g）。

3 結(jié)果與分析

3.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

魚肉中含豐富的脂肪酸和蛋白質(zhì)，乙酸乙酯提取目標(biāo)衍生物的同時(shí)，也會(huì)提取出這些非極性干擾物，影響定性和定量分析結(jié)果，增加儀器的維護(hù)成本。QuEChERS作為一種快速的前處理技術(shù)，最早應(yīng)用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)，一般分為萃取和凈化兩部分。萃取鹽包中的檸檬酸鈉和三水合二檸檬酸二鈉可保持提取溶液的pH穩(wěn)定；NaCl能促進(jìn)目標(biāo)物從水相到有機(jī)相的轉(zhuǎn)移；MgSO4能大量吸收樣品中的水分，減少水相，促進(jìn)目標(biāo)物在有機(jī)相中的轉(zhuǎn)移，且MgSO4的水合作用會(huì)放出大量熱量，更有利目標(biāo)物從水相轉(zhuǎn)移到有機(jī)相。C18和PSA是常用的吸附材料，其中C18除脂肪能力較強(qiáng)，PSA可同時(shí)減少脂類、糖類和其他有機(jī)酸的干擾，但魚肉中基質(zhì)復(fù)雜，分析脂肪含量較高的樣品時(shí)，C18和PSA的組合不能完全去除脂質(zhì)影響，因此本試驗(yàn)在美國Agilent公司提供的QuEChERS前處理方案基礎(chǔ)上，添加脂肪吸附能力更強(qiáng)的Al2O350 mg，達(dá)到更好的凈化效果。經(jīng)過改進(jìn)的QuEChERS前處理后，4種硝基呋喃代謝物衍生物的色譜分離結(jié)果見圖1。由圖1可見，4種硝基呋喃代謝物分離效果良好，峰形尖銳，無雜質(zhì)干擾，獲得良好的色譜分離效果。

圖1 4種硝基呋喃代謝物衍生物的色譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限、定量限

分別移取硝基呋喃代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液（100 ng/ml） 0.02，0.04，0.10，0.20，0.40 ml于50 ml離心管，除不加樣品外，按2.1項(xiàng)步驟前處理樣品，配制成1，2，5，10，20 μg/L系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各組分的濃度和峰面積建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3倍信噪比（S/N）為檢出限，以10倍S/N為定量限。各組分線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表3。

表3 4種硝基呋喃代謝物的標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)

由表3可見，各組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均在0.998以上，檢出限在0.07～0.16 μg/kg范圍內(nèi)，優(yōu)于農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1-2006標(biāo)準(zhǔn)要求，定量限均小于0.5 μg/kg，優(yōu)于標(biāo)準(zhǔn)要求。

3.3 方法回收率和精密度

準(zhǔn)確稱取4.00 g樣品于50 ml離心管，分別添加硝基呋喃代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 ng/ml）0.01，0.04，0.2 ml，4種代謝物的添加水平分別為0.25，1.00，5.00 μg/kg，按1.2步驟處理和凈化樣品，HPLC-MS/MS測(cè)定，做樣品加標(biāo)回收試驗(yàn)。每個(gè)加標(biāo)水平做6個(gè)平行試驗(yàn)，考察方法的回收率和精密度。4種目標(biāo)物的平均回收率為84 %～108 %，RSD為5.4 %～9.7 %，在農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1-2006要求范圍內(nèi)。3個(gè)濃度水平的回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 4種硝基呋喃代謝物的回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

3.4 實(shí)際樣品分析

采用本文建立的QuEChERS-HPLCMS/MS處理并檢測(cè)50批淡水魚樣品，結(jié)果僅有2份樣品中檢出AOZ陽性，其濃度分別為1.37和2.41 μg/kg，其他代謝物組分均未檢出。

4 小結(jié)

本文采用改進(jìn)的QuEChERS結(jié)合HPLC-MS/MS建立淡水魚中硝基呋喃代謝物殘留量的檢測(cè)方法，平均回收率為84 %～108 %，RSD為5.4 %～9.7 %，檢出限均小于0.2 μg/kg，定量限均小于0.5 μg/kg，各方法學(xué)性能指標(biāo)均優(yōu)于農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1-2006。該方法快速，簡(jiǎn)便，重復(fù)性好，靈敏度高，適用于淡水魚樣品中硝基呋喃代謝物的檢測(cè)分析，并為其他水產(chǎn)品中硝基呋喃代謝物的檢測(cè)提供參考。