藥品微生物實(shí)驗(yàn)室水系統(tǒng)分離37株微生物的鑒定及分析

袁 力，余 萌，王似錦，馬仕洪*

（1.河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州 450018；2.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

《中國(guó)藥典》2015年版二部共收載了純化水、注射用水及滅菌注射用水3種水[1]。藥典凡例中指出，試驗(yàn)用水除另有規(guī)定外，均系指純化水。目前，純化水可作為配制普通藥物制劑用的溶劑或試驗(yàn)用水，非滅菌制劑用器具的精洗用水。純化水在實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)基配制和消毒液配制、試驗(yàn)器皿清洗、樣品稀釋和處理等方面發(fā)揮著重要作用。注射用水可作為配制注射劑、滴眼劑等的溶劑或稀釋劑，及用于容器的精洗。藥品生產(chǎn)潔凈區(qū)的清洗、消毒劑的配制、料液的配制都離不開(kāi)注射用水。隨著微生物檢驗(yàn)技術(shù)不斷發(fā)展，人們對(duì)實(shí)驗(yàn)室用水帶來(lái)實(shí)驗(yàn)風(fēng)險(xiǎn)的認(rèn)識(shí)不斷深化和提高。制藥行業(yè)潔凈區(qū)環(huán)境菌（人、空氣、表面）以革蘭陽(yáng)性菌為主[2]，這是因?yàn)楦锾m陽(yáng)性菌通常不適合在液體環(huán)境中生存。但水系統(tǒng)中以革蘭陰性菌為主[3]，常見(jiàn)葉桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬。某些革蘭陰性菌喜歡水生棲息，并容易在水系統(tǒng)和其他潮濕環(huán)境形成生物膜[4]。生物膜對(duì)抗生素和宿主免疫防御機(jī)制的抗性很強(qiáng)。成熟的生物膜通過(guò)蔓延、部分脫落或釋放出浮游菌等進(jìn)行擴(kuò)展，脫落或釋放的細(xì)菌重新變成浮游菌，又可在物體的表面形成新的生物膜，且形成生物膜之后對(duì)消毒劑或抗生素的耐受性有可能增強(qiáng)[5]。因此，本研究對(duì)某藥品微生物實(shí)驗(yàn)室的水系統(tǒng)進(jìn)行了污染微生物的分離與鑒定，對(duì)水系統(tǒng)中分離菌的分布特點(diǎn)進(jìn)行了分析，并比較了常見(jiàn)的鑒定方法對(duì)水系統(tǒng)微生物的鑒定效果差異。

1 儀器與材料

1.1 儀器與設(shè)備

Milli-Q?HX 7080純水儀（德國(guó)Merck）；Elix?純水儀（德國(guó)Merck）；SQ810C型壓力滅菌器（日本Yamato）；EZ-S StreamTM（美國(guó)Millipore）；NU-543-600S型生物安全柜（美國(guó)Nuaire）；KD-240恒溫培養(yǎng)箱（德國(guó)Binder）；BX53光學(xué)顯微鏡（美國(guó)Olympus）；T100型PCR儀（美國(guó)Biorad）；Biolog MicroStation 微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)（美國(guó)Biolog）；Riboprinter全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)（美國(guó)Dupont）；BX53光學(xué)顯微鏡（日本Olympus）。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

一次性EZ濾杯（規(guī)格：100 ml；孔徑：0.45 μm；材質(zhì)：尼龍膜）；PrepGEM Bacteria PBA0100型DNA提取試劑盒（ZyGEM）；2×Taq Plus PCR MasterMix（Tiangen）；Riboprinter細(xì)菌鑒定套裝（美國(guó)Dupont）；BiologGENⅢ細(xì)菌鑒定板（美國(guó)Biolog）；R2A瓊脂培養(yǎng)基（美國(guó)BD公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分離與純化

使用Milli-Q?HX 7080 Water Purification System和Elix?Reference Water Purification System。二者均為二級(jí)純水系統(tǒng)，HX7080系統(tǒng)制備純水用于實(shí)驗(yàn)室消毒液配制、玻璃器皿清洗、高壓滅菌設(shè)備等日常使用，共包括5個(gè)取水點(diǎn)：進(jìn)場(chǎng)洗手池口、A區(qū)準(zhǔn)備區(qū)西口、A區(qū)準(zhǔn)備區(qū)東口、B區(qū)滅菌區(qū)口、消毒液配制口。Elix?Reference制備純水用于微生物培養(yǎng)基、緩沖溶液、試劑等的配制，共包括兩個(gè)取水點(diǎn)：B區(qū)準(zhǔn)備區(qū)配制口，B區(qū)儀器口。取樣時(shí)，兩臺(tái)純水儀處于開(kāi)機(jī)狀態(tài)，打開(kāi)各純水取水點(diǎn)開(kāi)關(guān)，持續(xù)出水3 min后，用無(wú)菌離心管分別在7個(gè)出口接取純化水各10 ml。

參照中國(guó)藥典2015年版四部通則1105，從上述無(wú)菌離心管中各取供試液1 ml，經(jīng)薄膜過(guò)濾法處理，采用R2A瓊脂培養(yǎng)基[6]，32.5 ℃培養(yǎng)24 h，然后22.5℃低溫繼續(xù)培養(yǎng)至5 d[7]。根據(jù)菌落特征，挑取平板中菌落，繼續(xù)用R2A平板劃線分離純化菌落，用于革蘭染色和微生物鑒定，并保存。

2.2 鑒定

2.2.1 革蘭染色 分離微生物經(jīng)固體培養(yǎng)基劃線純化獲得單菌落，在生物安全柜中，用無(wú)菌接種環(huán)挑取少量單菌落涂布于滴加無(wú)菌生理鹽水的載玻片上，自然晾干后，加熱固定，經(jīng)結(jié)晶紫初染1 min，碘液媒染1 min，酒精脫色20～30 s，番紅復(fù)染1 min，自然晾干后，光學(xué)顯微鏡下油鏡觀察。

2.2.2 16S rDNA序列分析 純化后的分離微生物用D N A提取試劑盒提取基因組，作為模板備用；16SrDNA序列引物為27f：5’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3’；1492R：5’TACGGYTACCTTGTTACGACTT3’。每25 μl反應(yīng)體系中包括2×Taq Plus PCR MasterMix，上下游引物各0.2 μmol，模板10 ng。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，50 ℃引物退火45 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物測(cè)序交由北京諾賽基因組研究中心有限公司完成。所得拼接結(jié)果輸入BLAST數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)。

2.2.3 Riboprinter全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定 采用Riboprinter對(duì)純化過(guò)的分離微生物進(jìn)行核糖體基因指紋圖譜分析。根據(jù)16S rDNA序列分析結(jié)果，針對(duì)各個(gè)出水口分離微生物，選擇不同屬水平代表菌株進(jìn)行Riboprinter分析。

2.2.4 生化鑒定 采用Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)對(duì)純化過(guò)的分離微生物進(jìn)行生化鑒定分析。

3 結(jié)果

3.1 實(shí)驗(yàn)室水系統(tǒng)微生物群落分布

對(duì)實(shí)驗(yàn)室7個(gè)出水口中收集到的37株微生物進(jìn)行鑒定分析。7個(gè)出水口的純化水來(lái)源于兩臺(tái)純水儀，按要求對(duì)各出水口純化水進(jìn)行檢測(cè)，從培養(yǎng)濾膜上，選取生長(zhǎng)表型（菌落大小，形態(tài)，顏色等）存在差異的菌落進(jìn)行進(jìn)一步分離純化，某些取水口菌株重復(fù)性較高，組成類(lèi)似，而某些取水口菌落則相對(duì)單一。培養(yǎng)基配制所用純化水由一臺(tái)純水儀單獨(dú)制備，取水位點(diǎn)分別為純水儀制水口和經(jīng)過(guò)濾膜過(guò)濾之后的培養(yǎng)基配制口。由16S rDNA序列分析結(jié)果可知，本實(shí)驗(yàn)室群落由8屬組成，分別為鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas），草螺菌屬（Herbaspirillum），青枯菌屬（Ralstonia），甲基桿菌屬（Methylobacterium），葉桿菌屬（Phyllobacterium），生根瘤菌屬（Mesorhizobium），新鞘氨醇菌屬（Novosphingobium），Methylorubrum屬；各屬占比分別為38 %，3 %，16 %，8 %，27 %，5 %，3 %，3 %，見(jiàn)圖1。

圖1 水系統(tǒng)微生物群落分布圖

3.2 水系統(tǒng)微生物鑒定結(jié)果

3.2.1 鏡檢結(jié)果 分離得到的37株菌染色結(jié)果均為革蘭陰性。占比最多的鞘氨醇單胞菌屬和葉桿菌屬染色鏡檢見(jiàn)圖2。鞘氨醇單胞菌屬為專(zhuān)性需氧的革蘭陰性菌，無(wú)芽胞，呈桿狀或略彎；葉桿菌屬為直桿狀革蘭陰性菌。

圖2 分離微生物部分鏡檢結(jié)果

3.2.2 鑒定方法比較 本實(shí)驗(yàn)共分離水系統(tǒng)中微生物37株，對(duì)這些微生物全部進(jìn)行16S rDNA序列分析，部分進(jìn)行Biolog生化鑒定及Riboprinter基因指紋圖譜鑒定（見(jiàn)表1）。Biolog鑒定系統(tǒng)主要是利用不同碳源進(jìn)行新陳代謝過(guò)程中產(chǎn)生的氧化還原酶與顯色物質(zhì)反應(yīng)導(dǎo)致的顏色變化及由于微生物生長(zhǎng)造成的濁度差異，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)菌株數(shù)據(jù)庫(kù)比較，得出鑒定結(jié)果。Riboprinter 鑒定系統(tǒng)是利用核糖體DNA在不同菌株中的拷貝數(shù)存在差異，用限制性內(nèi)切酶對(duì)細(xì)菌基因組進(jìn)行酶切，菌株之間的酶切片段長(zhǎng)度、數(shù)量存在差異，經(jīng)特異性探針標(biāo)記，形成菌株專(zhuān)一的指紋圖譜，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)中的圖譜比對(duì)，得到鑒定結(jié)果。相似度值高于0.85時(shí)，結(jié)果可信，相似度值低于0.85時(shí)，結(jié)果不可信[8]。16S rDNA序列分析對(duì)上述微生物能給出屬/種水平的鑒定結(jié)果；Biolog給出鑒定結(jié)果的有13株，在屬水平與16S rDNA序列分析一致的有5株；Riboprinter給出鑒定結(jié)果的有17株，其中相似度值大于0.85的只有2株，在屬水平與16S rDNA序列分析一致的有11株。以上結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)所采用的生化鑒定方法和核糖體分型方法對(duì)水系統(tǒng)中微生物的鑒定能力不足，究其原因，通過(guò)比對(duì)Biolog和Riboprinter的菌種數(shù)據(jù)庫(kù)，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)我們所分離的目標(biāo)微生物覆蓋不足，即這些水系統(tǒng)中的微生物并未納入這兩個(gè)鑒定系統(tǒng)的數(shù)據(jù)庫(kù)中，成為導(dǎo)致鑒定成功率較低的原因之一。此外，對(duì)于核糖體分型系統(tǒng)而言，即使數(shù)據(jù)庫(kù)中收載了相應(yīng)種/屬的微生物，但建庫(kù)所用菌株太少，以致代表性不足，也可能導(dǎo)致鑒定準(zhǔn)確性降低。

表1 3種鑒定方法分析結(jié)果對(duì)比

4 討論

目前有關(guān)實(shí)驗(yàn)室水系統(tǒng)微生物群落分布規(guī)律的報(bào)道較少。試驗(yàn)用水廣泛應(yīng)用于微生物實(shí)驗(yàn)室的培養(yǎng)基及消毒劑的配制、器皿洗滌、樣品稀釋和處理等方面。微生物檢驗(yàn)結(jié)論正確的前提是使用的培養(yǎng)基未受污染，而影響培養(yǎng)基質(zhì)量的因素除培養(yǎng)基本身的配方質(zhì)量、保存條件、滅菌條件等，配制培養(yǎng)基使用的試驗(yàn)用水中微生物污染情況是另一個(gè)重要因素，加強(qiáng)試驗(yàn)用水的日常監(jiān)控和微生物污染狀況的研究，對(duì)于合理、有效地規(guī)范制水系統(tǒng)和儲(chǔ)水裝置的消毒、清洗周期和頻率有重要的參考意義。

4.1 菌株分離純化方法的選擇

對(duì)于純凈水的微生物限度檢查，各國(guó)藥典的規(guī)定見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，中國(guó)藥典和歐洲藥典均采用薄膜過(guò)濾法，使用R2A瓊脂培養(yǎng)基，30～35 ℃培養(yǎng)5 d，而美國(guó)藥典的檢驗(yàn)方法并未固定，培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間均可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行選擇[9]。研究發(fā)現(xiàn)，方法一：采用R2A培養(yǎng)基于32.5 ℃培養(yǎng)5 d；方法二：采用R2A培養(yǎng)基于32.5 ℃培養(yǎng)24 h后再于22.5 ℃低溫繼續(xù)培養(yǎng)至5 d；二者相比，R2A培養(yǎng)基先高溫再低溫培養(yǎng)產(chǎn)生的微生物種類(lèi)和數(shù)量較32.5 ℃恒溫培養(yǎng)更多，原因是有些水生微生物適合低溫生長(zhǎng)[7]。故最后選用方法二進(jìn)行試驗(yàn)。

4.2 純化水的微生物分布特點(diǎn)

分析本實(shí)驗(yàn)室水系統(tǒng)微生物的構(gòu)成，鞘氨醇單胞菌屬占38 %，葉桿菌屬占27 %，分布特點(diǎn)與國(guó)外水系統(tǒng)監(jiān)測(cè)相關(guān)報(bào)道[10]基本一致。

4.3 不同方法對(duì)水系統(tǒng)中微生物的鑒定效果比較

本實(shí)驗(yàn)分別運(yùn)用基因型（16S rDNA序列分析）、Riboprinter全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)），表型（Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)）鑒定方法對(duì)檢出微生物進(jìn)行分析。16S rDNA序列分析作為細(xì)菌鑒定或系統(tǒng)發(fā)育分析最常見(jiàn)的基因型方法[11]，對(duì)水系統(tǒng)中分離微生物，在屬水平至種水平具有良好的鑒定效果。前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)Riboprinter基因指紋圖譜鑒定技術(shù)對(duì)于水系統(tǒng)中微生物的鑒定效果不佳，推測(cè)由于數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)菌種的帶型收錄量不足導(dǎo)致，因此未對(duì)所有菌株進(jìn)行該項(xiàng)目的分析。但此種分析方法具備溯源分析的能力（見(jiàn)表1）。以生化反應(yīng)為鑒定依據(jù)的Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)分析鑒定結(jié)果與16S rDNA序列分析相比，屬水平的鑒定準(zhǔn)確率為35 %，種水平則為13.5 %，原因是水系統(tǒng)中微生物具有寡養(yǎng)、嗜低溫、生長(zhǎng)緩慢的特性，Biolog微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)建庫(kù)條件為33 ℃，最長(zhǎng)36 h的培養(yǎng)，這些菌株在此條件下往往未能將其代謝特征充分表達(dá)，因此在鑒定失敗時(shí)，系統(tǒng)給出的原因往往是陽(yáng)性反應(yīng)孔少，無(wú)法與數(shù)據(jù)庫(kù)中錄入菌株進(jìn)行比較。綜上，對(duì)于水系統(tǒng)中微生物的鑒定分析，16S rDNA序列分析能獲得較準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。

4.4 分離微生物特性

16S rDNA序列分析的鑒定結(jié)果顯示，占比最多的是鞘氨醇單胞菌屬[12]，其次是葉桿菌屬和青枯菌屬。這些菌的共同特點(diǎn)是常見(jiàn)于潮濕的環(huán)境中，如土壤、河流、湖泊等。青枯菌屬在水系統(tǒng)管道中易形成生物膜[12]，能分解芳香烴和酚類(lèi)物質(zhì)，因此能耐受酚類(lèi)消毒劑。文獻(xiàn)報(bào)道[13]純化水中常見(jiàn)分離微生物類(lèi)群基本一致，這些微生物均為革蘭陰性桿菌，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，通?？稍谒疄榻橘|(zhì)的寡養(yǎng)條件下生長(zhǎng)。一般認(rèn)為，無(wú)論是無(wú)菌藥品還是非無(wú)菌藥品，污染革蘭陰性桿菌的危害會(huì)高于其他種類(lèi)的細(xì)菌[9]。近年，與微生物相關(guān)的召回事件明顯增加，美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）在非無(wú)菌召回事件中，一半以上的召回是因?yàn)楦锾m陰性桿菌的污染。因此，要對(duì)水系統(tǒng)中污染微生物的數(shù)量和種類(lèi)加以關(guān)注，必要的情況下，應(yīng)采取適當(dāng)?shù)拇胧14]。

表2 純凈水微生物限度檢查各國(guó)藥典對(duì)比

4.5 污染原因分析及建議

與制藥工業(yè)中的純水系統(tǒng)相比，本實(shí)驗(yàn)室的水系統(tǒng)未使用循環(huán)水設(shè)計(jì)，除終端取水口裝有除菌過(guò)濾器外，7個(gè)出水口均未采取有效的消毒滅菌措施。依靠終端過(guò)濾器僅能對(duì)儲(chǔ)水器和流經(jīng)管路的水進(jìn)行單次純化，無(wú)法有效地降低微生物滋生的風(fēng)險(xiǎn)。另外，實(shí)驗(yàn)室水系統(tǒng)配置的儲(chǔ)水器容積偏大，或管路過(guò)長(zhǎng)，特別是取樣部位和分路支管存有積水，同樣會(huì)增大樣本微生物污染的風(fēng)險(xiǎn)。

為減少微生物污染，建議實(shí)驗(yàn)室水系統(tǒng)選擇較小的儲(chǔ)水器，儲(chǔ)水器前端和終端均安裝除菌過(guò)濾器，必要時(shí)可在儲(chǔ)水器中安裝加熱消毒裝置、紫外線消毒裝置或定期使用化學(xué)試劑消毒，并保證系統(tǒng)的管道盡可能短。

5 結(jié)論

本研究對(duì)微生物實(shí)驗(yàn)室的水系統(tǒng)進(jìn)行了微生物檢驗(yàn)，并對(duì)分離菌進(jìn)行了鑒定與分析，分離得到的37株菌均為革蘭陰性菌，大多數(shù)菌具有寡營(yíng)養(yǎng)、嗜低溫、易形成生物膜的特點(diǎn)，有些菌為條件致病菌。本研究初步表明：采用16S rDNA序列分析技術(shù)對(duì)水系統(tǒng)中微生物鑒定效果較好，Riboprinter全自動(dòng)微生物基因指紋鑒定系統(tǒng)則更適用于近緣微生物的分型溯源，自動(dòng)生化鑒定系統(tǒng)對(duì)于水系統(tǒng)微生物的鑒定效果不佳。建議對(duì)實(shí)驗(yàn)室水系統(tǒng)要定期進(jìn)行微生物檢驗(yàn)，并根據(jù)監(jiān)測(cè)情況定期采取消毒措施，如熱消毒、化學(xué)試劑消毒、沖洗或排放等方法。若純化水用于培養(yǎng)基或消毒劑的配制，使用前可使用濾膜過(guò)濾，并定期更換濾膜。