環(huán)境因素對(duì)胡椒瘟病菌游動(dòng)孢子產(chǎn)量的影響①

高圣風(fēng) 楊開虎 劉愛勤 茍亞峰 孫世偉 王 政 孟倩倩

(1 中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院香料飲料研究所 海南萬寧 571533;2 海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質(zhì)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 海南萬寧 571533;3 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)熱帶作物學(xué)院 云南普洱 665000)

胡椒瘟病廣泛分布于世界上所有胡椒生產(chǎn)國(guó)家和地區(qū)，也是危害中國(guó)胡椒生產(chǎn)的首要病害，其病原物是辣椒疫霉（Phytophthora capsiciLeon.）［1-2］。該病害于 20 世紀(jì) 70 年代在中國(guó)海南主產(chǎn)區(qū)一度爆發(fā)流行，摧毀了大片胡椒園，致使海南省胡椒種植面積縮減20%以上［3-4］。胡椒瘟病主要危害胡椒主蔓基部，植株染病后死亡率極高，可隨風(fēng)雨和農(nóng)事操作向四周迅速傳播，控制病源和切斷傳播途徑是防控該病害的一貫方針［3-4］。

游動(dòng)孢子在有水環(huán)境中能夠識(shí)別寄主并主動(dòng)游到寄主表面完成侵染，是辣椒疫霉最主要的侵染源和傳播形式［5-6］。游動(dòng)孢子的數(shù)量多少是決定辣椒疫霉病害能否爆發(fā)流行的關(guān)鍵，也是國(guó)內(nèi)外科學(xué)家關(guān)注的熱點(diǎn)。程穎超等［7］分析了Actin基因序列差異并特異性引物YM2F/YM2R，開發(fā)了基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的游動(dòng)孢子定量檢測(cè)技術(shù)，以監(jiān)測(cè)和評(píng)估病害發(fā)生趨勢(shì)。Dong 等［8］基于辣椒疫霉ITS 序列的特異性和環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP），建立了更為簡(jiǎn)便快速的辣椒疫霉定性檢測(cè)技術(shù)。Ivey 等［9］開發(fā)了利用熒光染料 FUN-1 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)辣椒疫霉游動(dòng)孢子產(chǎn)量的方法。明確自然環(huán)境中影響胡椒瘟病菌游動(dòng)孢子產(chǎn)量的因素，是認(rèn)識(shí)和防控該病害的重要基礎(chǔ)。

培養(yǎng)基對(duì)辣椒疫霉游動(dòng)孢子產(chǎn)量的影響廣受關(guān)注。已報(bào)道的辣椒疫霉產(chǎn)孢培養(yǎng)基種類有很多，包括V8 蔬菜汁培養(yǎng)基（V8），黑麥培養(yǎng)基（RA）、胡蘿卜培養(yǎng)基 （CA）、大豆培養(yǎng)基 （BA） 等等［9-12］。但是，不同來源的菌株在相同培養(yǎng)基上的游動(dòng)孢子產(chǎn)量存在差異。張榮等［13］采用光照誘導(dǎo)的方法分析了來源于廣州的辣椒疫霉在5種培養(yǎng)基上的游動(dòng)孢子產(chǎn)量，發(fā)現(xiàn)其在燕麥瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生游動(dòng)孢子的數(shù)量最多。侯全剛［14］對(duì)同樣5 種培養(yǎng)基開展研究，發(fā)現(xiàn)分離自青海循化縣的辣椒疫霉在馬鈴薯培養(yǎng)基上的游動(dòng)孢子產(chǎn)量顯著高于其他培養(yǎng)基［14］。

影響辣椒疫霉游動(dòng)孢子產(chǎn)量的環(huán)境因素有很多，其中光照是公認(rèn)的誘導(dǎo)辣椒疫霉產(chǎn)生游動(dòng)孢子的必要條件。王曉敏等［15］和李立鳳等［16］分析不同光照方式對(duì)辣椒疫霉游動(dòng)孢子產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)持續(xù)黑暗培養(yǎng)無法產(chǎn)生游動(dòng)孢子，全光照條件下游動(dòng)孢子產(chǎn)量顯著高于間歇性光照，全光培養(yǎng)條件下游動(dòng)孢子產(chǎn)量隨光照時(shí)間的延長(zhǎng)而增多［15-16］。許亞池等［12］研究發(fā)現(xiàn)，黑暗培養(yǎng) 5 d 的辣椒疫霉菌經(jīng)光照誘導(dǎo)后可以產(chǎn)生多達(dá)106個(gè)/mL的游動(dòng)孢子，加入無菌水淹沒菌絲能夠顯著提高游動(dòng)孢子產(chǎn)量。蘭成忠等［10］研究發(fā)現(xiàn)，辣椒疫霉經(jīng)黑暗培養(yǎng)后，用玻棒將菌絲輕輕涂抹壓倒后再光照誘導(dǎo)，獲得的游動(dòng)孢子產(chǎn)量顯著高于加無菌水淹沒菌絲后直接光照誘導(dǎo)［10］。誘導(dǎo)辣椒疫霉產(chǎn)孢的溫度條件通常認(rèn)為25～26℃最佳，但是不同來源的菌株間也存在差異。侯全剛［14］發(fā)現(xiàn)分離自青海循化縣的辣椒疫霉在22～32℃均可產(chǎn)孢，30℃時(shí)產(chǎn)孢量最高。此外，自然環(huán)境中作物根系分泌物對(duì)辣椒疫霉游動(dòng)孢子產(chǎn)量也有影響。王繼元等［17］發(fā)現(xiàn)，在不同抗性的品種之間，抗病強(qiáng)的辣椒品種PRMND 和DNP56 的根系分泌物能夠顯著抑制辣椒疫霉游動(dòng)孢子囊形成，而感病品種‘科星6號(hào)’則沒有明顯差異。

以上相關(guān)研究中的辣椒疫霉菌株均分離自辣椒、南瓜等溫帶蔬菜作物。胡椒瘟病菌雖然屬于辣椒疫霉種，但是其在遺傳學(xué)系統(tǒng)發(fā)育樹上與來源于溫帶的辣椒、茄子等作物上的辣椒疫霉菌，分屬不同的分類亞群［18］。目前尚未見胡椒瘟病菌產(chǎn)孢影響因素相關(guān)報(bào)道。前期，本研究室建立了胡椒瘟病孢子囊及游動(dòng)孢子誘導(dǎo)方法，在V8 培養(yǎng)基上連續(xù)光照培養(yǎng)可以誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的游動(dòng)孢子［19］。在此基礎(chǔ)上，本研究分析光照強(qiáng)度、溫度、相對(duì)濕度和pH 變化對(duì)胡椒瘟病菌產(chǎn)孢的影響，為認(rèn)識(shí)胡椒瘟病成災(zāi)機(jī)制和建立針對(duì)性病害防控措施奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及保存

胡椒瘟病菌（P. capsici）分離自海南省萬寧市胡椒病株，由本研究室近期分離鑒定，室溫保存于PDA斜面試管中。

1.1.2 培養(yǎng)基

誘導(dǎo)胡椒瘟病菌產(chǎn)孢所用的培養(yǎng)基為10% V8蔬菜汁瓊脂（V8-A）培養(yǎng)基，配制方法如下： 將V8 蔬菜汁在5 000 g 條件下離心5 min，取上清液100 mL，加入CaCO31 g、瓊脂粉20 g，用去離子水定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 至7.0，分裝后于121℃滅菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 不同環(huán)境條件下胡椒瘟病菌游動(dòng)孢子誘導(dǎo)

將胡椒瘟病菌接種在V8-A平板中央，用錫紙包裹避光，在26℃條件下黑暗培養(yǎng)7 d 后解除錫紙；用無菌玻璃棒輕輕涂壓菌絲使其貼附于平板表面，在恒溫光照培養(yǎng)箱（珠江牌，LRH-800-GSI Plus）中誘導(dǎo)產(chǎn)孢48 h，每個(gè)平板加入無菌水10 mL，先4℃恒溫1 h 后再26℃恒溫1 h，使游動(dòng)孢子充分釋放；在此基礎(chǔ)上，將“在恒溫光照培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)產(chǎn)孢48 h”階段設(shè)置不同的光照強(qiáng)度、溫度、相對(duì)濕度、pH 等環(huán)境條件處理，檢測(cè)不同條件對(duì)胡椒瘟病菌游動(dòng)孢子產(chǎn)量的影響。所有試驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)重復(fù)。按環(huán)境因子分別將各試驗(yàn)處理介紹如下。

1.2.1.1 光照強(qiáng)度

共設(shè)置6 個(gè)處理，光照強(qiáng)度分別為黑暗處理、200、2 000、5 000、10 000 和 20 000 lx。其中黑暗處理用雙層錫紙包裹；光照條件通過恒溫光照培養(yǎng)箱設(shè)置，用照度計(jì)（Spectrum，3414FQF）確認(rèn)平板放置位點(diǎn)的實(shí)際光照強(qiáng)度，當(dāng)光照強(qiáng)度無法達(dá)到設(shè)定值時(shí)添加適量的白光LED燈補(bǔ)光。按照6 個(gè)不同光照強(qiáng)度進(jìn)行游動(dòng)孢子誘導(dǎo)，其他試驗(yàn)條件均為26℃、pH7.0、密封平板內(nèi)自然濕度。

1.2.1.2 溫度

共設(shè)置5個(gè)處理，溫度分別為15、20、25、30和35℃。溫度條件通過光照培養(yǎng)箱（珠江牌，LRH-800-GSI Plus）進(jìn)行設(shè)置。培養(yǎng)箱內(nèi)實(shí)際溫度通過溫濕度計(jì)（OMEGA，OM-HL-SH-TH）進(jìn)行確認(rèn)。按照5個(gè)不同溫度條件進(jìn)行游動(dòng)孢子誘導(dǎo)，其他試驗(yàn)條件均為光照強(qiáng)度5 000 lx、pH7.0、密封平板內(nèi)自然濕度。

1.2.1.3 濕度

共設(shè)置5 個(gè)處理，相對(duì)濕度分別約為50%、65%、85%、95%和99%。無菌環(huán)境的濕度條件通過以下方法獲得：在容量為1 L 的燒杯中加入800 mL蛭石后用封口膜封口，以121℃滅菌30 min 后放入90℃電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中干燥24 h，在超凈工作臺(tái)中分別加入無菌水0、75、150、300、600 mL，置于26℃恒溫24 h，使用溫濕度計(jì)（OMEGA，OMHL-SH-TH） 檢測(cè)燒杯中空氣濕度分別約為50%、65%、85%、95%和99%；在超凈工作臺(tái)中將待誘導(dǎo)產(chǎn)孢的平板去除上蓋，放入燒杯中的蛭石上，封口后放入光照培養(yǎng)箱中，在5 000 lx、26℃、pH 7.0條件下誘導(dǎo)游動(dòng)孢子。

1.2.1.4 pH

共設(shè)置7 個(gè)處理，pH 值分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和10.0。將磷酸氫鹽緩沖液（gibco，1×PBS）加無菌水稀釋10 倍，使用pH 計(jì)（Mettler-Toledo ， SevenCompact S210） 調(diào)節(jié)pH至各梯度值，形成7 種不同pH 的處理液；分別向待誘導(dǎo)產(chǎn)孢的平板中加入10 mL 處理液浸泡菌絲，以形成不同的pH環(huán)境，在5 000 lx、26℃、液體環(huán)境條件下誘導(dǎo)游動(dòng)孢子，后期不再加入無菌水。

1.2.2 游動(dòng)孢子產(chǎn)量調(diào)查

將產(chǎn)孢平板中液體輕輕搖晃均勻，吸取20μL滴加在血球計(jì)數(shù)板（XB-K-25）上，輕輕蓋上蓋玻片，置于奧林巴斯IX73 顯微鏡載物臺(tái)上，用10×40 倍視野進(jìn)行觀察。每個(gè)平板制作3 個(gè)臨時(shí)裝片，每個(gè)裝片統(tǒng)計(jì)中央大方格四角處4個(gè)方格內(nèi)的游動(dòng)孢子總數(shù)（n100），根據(jù)公式計(jì)算游動(dòng)孢子濃度［12］：游動(dòng)孢子濃度（個(gè)/mL）＝n100×4×104。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行分析處理，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），費(fèi)雪最小顯著差異檢驗(yàn)（Fisher’sleast-signifi‐cant difference test，LSD）（p＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 光照強(qiáng)度對(duì)游動(dòng)孢子產(chǎn)量的影響

結(jié)果顯示，在其他因素一致的情況下，光照強(qiáng)度對(duì)胡椒瘟病菌游動(dòng)孢子產(chǎn)量影響很大（圖1）。隨著光照強(qiáng)度在0～20 000 lx 逐步增強(qiáng)，胡椒瘟病菌游動(dòng)孢子產(chǎn)量呈拋物線趨勢(shì)。黑暗條件下不產(chǎn)生游動(dòng)孢子，隨光照增強(qiáng)產(chǎn)孢量迅速上升；在5 000 lx條件下產(chǎn)孢量達(dá)到頂峰，為1.10×106個(gè)/mL，分別是 2 000 和 10 000 lx 條件下的 6.89 倍和 12.40 倍；在10 000 lx條件下產(chǎn)孢量?jī)H有8.89×104個(gè)/mL，與20 000 lx 條件下的產(chǎn)孢量無顯著性差異（p＜0.05）。

2.2 溫度因素對(duì)游動(dòng)孢子產(chǎn)量的影響

結(jié)果顯示，在其他因素一致的情況下，溫度條件變化能夠明顯影響胡椒瘟病菌游動(dòng)孢子產(chǎn)量（圖2）。在15～35℃培養(yǎng)條件下，均能誘導(dǎo)胡椒瘟病菌產(chǎn)生游動(dòng)孢子，其產(chǎn)量隨溫度上升呈拋物線趨勢(shì)。在25℃條件下的產(chǎn)孢量最高，達(dá)1.11×106個(gè)/mL；拋物線在頂點(diǎn)左右基本對(duì)稱，在20和30℃條件下也能產(chǎn)生大量游動(dòng)孢子，分別為5.82×105和7.29×105個(gè)/mL；在15 和35℃條件下的產(chǎn)孢量遠(yuǎn)低于其他溫度條件，處于1×104個(gè)/mL 水平。除了15 和35℃2 個(gè)處理之間的產(chǎn)孢量差異不顯著之外，其他所有處理間均存在顯著性差異（p＜0.05）。

2.3 濕度因素對(duì)游動(dòng)孢子產(chǎn)量的影響

結(jié)果顯示，在其他因素一致的情況下，相對(duì)濕度因素對(duì)胡椒瘟病菌游動(dòng)孢子產(chǎn)量具有一定的影響（圖3）。隨著相對(duì)濕度在50%～99%逐步上升，胡椒瘟病菌游動(dòng)孢子產(chǎn)量呈先略微上升再明顯下降的趨勢(shì)。相對(duì)濕度在50%和60%條件下，產(chǎn)孢量分別為1.01×106和1.16×106個(gè)/mL，但二者間差異不顯著；隨濕度上升游動(dòng)孢子產(chǎn)量呈顯著下降趨勢(shì)；99%濕度條件下的產(chǎn)孢量低于95%濕度條件，但差異不顯著（p＜0.05）。

2.4 pH因素對(duì)游動(dòng)孢子產(chǎn)量的影響

結(jié)果顯示，在其他因素一致的情況下，環(huán)境pH 變化對(duì)胡椒瘟病菌游動(dòng)孢子產(chǎn)量影響較大（圖4）。隨著pH 在4.0～10.0 逐步上升，胡椒瘟病菌游動(dòng)孢子產(chǎn)量呈先升后降的拋物線趨勢(shì)。pH 6.0～8.0 時(shí)產(chǎn)孢量較高，其中pH 7.0 的產(chǎn)孢量最高，為5.14×104個(gè)/mL；過酸（≤pH 5.0）或者過堿（≥pH 9.0）的環(huán)境中游動(dòng)孢子產(chǎn)量均迅速下降。

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

眾多研究表明，辣椒疫霉在黑暗條件不產(chǎn)生游動(dòng)孢子，光照是誘導(dǎo)產(chǎn)孢的重要前提條件。但是，侯全剛［14］、王曉敏等［15］和李立鳳等［16］研究發(fā)現(xiàn)，持續(xù)光照比間歇式光照更有利于辣椒疫霉產(chǎn)生游動(dòng)孢子，并未計(jì)量光照強(qiáng)度。何烈干等［20］、劉裴清等［21］和蘭成忠等［22］研究認(rèn)為，誘導(dǎo)辣椒疫霉產(chǎn)孢的光照強(qiáng)度分別為2 000、800 和500 lx不等。本研究首次分析了不同光照強(qiáng)度對(duì)胡椒瘟病菌游動(dòng)孢子產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)5 000 lx光照強(qiáng)度下胡椒瘟病菌游動(dòng)孢子產(chǎn)量最高，該光照強(qiáng)度遠(yuǎn)高于上述研究中的光照強(qiáng)度。需要注意的是，胡椒瘟病菌雖然屬于辣椒疫霉，但是其在遺傳學(xué)系統(tǒng)發(fā)育樹上與來源于溫帶的辣椒、茄子等溫帶作物上的辣椒疫霉分屬不同的分類亞群［18］，推測(cè)來自熱帶的胡椒瘟病菌最適光照強(qiáng)度高于來自溫帶的辣椒疫霉。另外，陰雨天氣室外的光照強(qiáng)度范圍是50～500 lx，晴天室外光照強(qiáng)度范圍是10 000～100 000 lx。所以推測(cè)，自然環(huán)境中陰雨過后至天氣轉(zhuǎn)晴前這段時(shí)間的光照條件最適合胡椒瘟病菌產(chǎn)生游動(dòng)孢子。

國(guó)內(nèi)外報(bào)道中，誘導(dǎo)辣椒疫霉產(chǎn)生游動(dòng)孢子的溫度條件通常為 25～28℃［1，9-13，15-16］，但也有例外，侯全剛［14］發(fā)現(xiàn)分離自青海線椒上的辣椒疫霉在30℃時(shí)產(chǎn)孢量最高［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，胡椒瘟病菌最適產(chǎn)孢溫度是25℃，在20～30℃均能產(chǎn)生大量游動(dòng)孢子，該最適產(chǎn)孢溫度與當(dāng)前國(guó)內(nèi)外普遍選用的游動(dòng)孢子誘導(dǎo)溫度一致。桑利偉等［2-3］報(bào)道稱，中國(guó)胡椒主產(chǎn)區(qū)海南省胡椒瘟病周年均可發(fā)生，4月和10月是病害發(fā)生高峰期，該地區(qū)周年溫度條件中，2～12 月份平均溫度均在20～30℃，僅1月份平均溫度略低（約18℃），2個(gè)發(fā)病高峰期的月平均溫度均約為26℃。由此推測(cè)，胡椒瘟病在海南周年均可發(fā)生可能與全年溫度均較適合產(chǎn)孢有關(guān)，病害發(fā)生率與游動(dòng)孢子產(chǎn)量可能呈正相關(guān)關(guān)系。

對(duì)于辣椒疫霉產(chǎn)生游動(dòng)孢子的濕度條件，國(guó)內(nèi)外多采用環(huán)境自然濕度或者室內(nèi)培養(yǎng)時(shí)平板內(nèi)的自然濕度［1，9-16］，尚未見關(guān)于環(huán)境濕度對(duì)產(chǎn)孢量影響的研究，這可能與建立無菌恒濕的環(huán)境條件難度大有關(guān)。本研究嘗試向無菌燒杯里加入不同比例的干燥蛭石和水以建立不同濕度梯度的無菌環(huán)境，發(fā)現(xiàn)在恒溫條件下不同處理的燒杯中，空氣相對(duì)濕度呈現(xiàn)較為穩(wěn)定的濕度梯度。基于此裝置，本研究首次分析了空氣濕度對(duì)胡椒瘟病菌游動(dòng)孢子產(chǎn)量的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在50%～99%的濕度范圍內(nèi)，胡椒瘟病菌均有較高的產(chǎn)孢量（≥2.27×105個(gè)/mL），其中相對(duì)濕度較低 （50% 和65%）時(shí)的產(chǎn)孢量顯著高于高濕度條件（≥85%），說明胡椒瘟病菌可能偏好在較為干燥的環(huán)境中產(chǎn)孢。

本研究發(fā)現(xiàn)，環(huán)境條件為pH 7.0 時(shí)，胡椒瘟病菌游動(dòng)孢子產(chǎn)量最高，這與侯全剛［14］報(bào)道一致。此外，本研究為了創(chuàng)建不同pH 梯度的產(chǎn)孢環(huán)境，在誘導(dǎo)產(chǎn)孢平板上加入了不同pH 的PBS 緩沖液浸泡菌絲，但是獲得的游動(dòng)孢子產(chǎn)量最大僅為5.14×104個(gè)/mL，遠(yuǎn)低于其他3 種因素試驗(yàn)中的最大產(chǎn)孢量（約1.0×106個(gè)/mL），說明磷酸緩沖液浸泡不利于胡椒瘟病產(chǎn)生游動(dòng)孢子。

3.2 結(jié)論

研究結(jié)果表明，光照強(qiáng)度、溫度、相對(duì)濕度、pH 等環(huán)境因素均對(duì)胡椒瘟病菌游動(dòng)孢子產(chǎn)量具有顯著影響，胡椒瘟病菌產(chǎn)生游動(dòng)孢子最適宜的環(huán)境條件約為：光照強(qiáng)度5 000 lx、溫度25℃、相對(duì)濕度65%、pH 7.0。