a-乙酰乳酸脫羧酶（ALDC）對釀酒中雙乙?？刂菩Ч芯?/h1>
2020-10-21 03:50:24李忠英羅躍中劉軍
科技創(chuàng)新與應(yīng)用 2020年30期
李忠英 羅躍中 劉軍
摘? 要：文章研究了α-乙酰乳酸脫羧酶（ALDC）對啤酒雙乙酰含量的影響。已知ALDC通過繞過雙乙酰生成途徑來減少雙乙酰。在此，在添加ALDC的條件下釀造啤酒。游離氨基氮（如纈草堿）對雙乙酰的生成有相反的影響。在樣品中加入0.02，0.04，0.06單位/mL的ALDC，并對所得啤酒的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，以確定啤酒的質(zhì)量。雙乙酰含量隨酶濃度的增加而降低。樣品中的二乙?；糠謩e降低了25%和15%，產(chǎn)品質(zhì)量大大提高。
關(guān)鍵詞：a-乙酰乳酸脫羧酶（ALDC）;釀酒;雙乙酰控制效果;研究
中圖分類號：O657? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ?文章編號：2095-2945（2020）30-0066-02
Abstract： The effect of α-acetolactate decarboxylase （ALDC） on the content of diacetyl in beer was studied. ALDC is known to
reduce diacetyl by bypassing the diacetyl formation pathway. Here， beer is brewed under the condition of adding ALDC. Free amino nitrogen （such as valine） has the opposite effect on the formation of diacetyl. The ALDC of 0.02， 0.04， and 0.06 unit/mL was added to the sample and the physical and chemical properties of the beer were analyzed to determine the quality of the beer. The content of diacetyl decreased with the increase of enzyme concentration. The diacetyl content in the sample was reduced by 25% and 15% respectively， and the product quality was greatly improved.
Keywords： α-acetolactate decarboxylase （ALDC）; wine making; diacetyl control effect; study
引言
雙乙酰是一種風(fēng)味化合物，由微生物代謝而成，存在于葡萄酒、奶酪和啤酒等發(fā)酵食品中。然而，啤酒中雙乙酰的存在是不可取的，因?yàn)樗狞S油味道。啤酒中雙乙酰的閾值為0.1～0.15μg/mL，采用多種方法對其進(jìn)行降低或消除。可通過使用不同菌株的投料酵母、控制投料率、在麥汁中添加纈草堿或控制麥芽汁的含量來控制麥汁的含量。
1 調(diào)節(jié)氨基酸與發(fā)酵糖的比例
a-乙酰乳酸被細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為valine或排泄，并通過非常慢的非酶反應(yīng)（13）而脫羧為雙乙酰。通過雙乙酰休息，少量的剩余酵母再吸收蟲草中的雙乙酰，并通過酵母還原酶將其還原為風(fēng)味較弱的乙酰丙酮和丁二醇。然而，At-乙酰乳酸脫羧酶（ALDC）是由一株改良的枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilisis）生產(chǎn)的酶，不存在于瀝青酵母中，它可以繞過雙乙酰生成或減少雙乙酰生成，直接將α-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為乙酰丙酮。本研究采用ALDC對啤酒中的雙乙酰進(jìn)行還原，并與傳統(tǒng)的陳釀啤酒進(jìn)行了比較。[2]此外，還研究了在酶存在下對啤酒質(zhì)量的影響。
2 材料和方法
所使用的投球酵母是Hefeweizenale酵母WLP 300。采用傳統(tǒng)顆粒型啤酒花，a-酸含量為10%。麥芽自動微麥芽系統(tǒng)被用于格式化（浸泡，發(fā)芽和燒制）。在15℃下用濕式浸泡和干式浸泡進(jìn)行浸泡，重復(fù)三次。[3]在16%C下發(fā)芽5d，然后拔除根部。在45℃下燒制30min，溫度提高5℃/min，最終溫度達(dá)到65℃，然后迅速提高到80℃（18℃），麥芽用滾筒磨在1mm的間隙。采用糊化法進(jìn)行糖化。在45℃下，將50克砂礫與200mL蒸餾水混合，在45%C下攪拌30 min，然后將溫度提高1℃/min，直至終溫達(dá)到70℃。加入熱蒸餾水（70℃），在相同溫度下繼續(xù)攪拌1h。麥汁在20℃快速冷卻，加入蒸餾水調(diào)節(jié)到450g，麥汁過濾采用濾紙過濾。麥汁用間歇性添加的啤酒花煮熟（占總量的一半，10分鐘，1/4，5分鐘和1/4，5分鐘），然后在冰上快速冷卻。初始比重法測定酒精含量和糖化度，添加酵母（約6個對數(shù)細(xì)胞/mL）和0.02，0.04，0.06單位/mL ALDC，在20%C下進(jìn)行初級發(fā)酵4天。將啤酒轉(zhuǎn)瓶后，在15%C條件下進(jìn)行二次發(fā)酵7天，以酶產(chǎn)生量1mmol/min確定為ALDC活性單位。使用比重計測定了比重。在初級發(fā)酵結(jié)束和二次發(fā)酵結(jié)束時，比較了樣品的比重和對照值的變化。分析酵母活力，活細(xì)胞（對數(shù)細(xì)胞/mL）還原亞甲基藍(lán)。[4]
為了變白，使用血細(xì)胞計（Marienfeld-Superior，Lauda-K nigshofen，德國）。第一次發(fā)酵和二次發(fā)酵分別進(jìn)行4天和7天的Viablecell計數(shù)，并與未用酶處理的對照樣品進(jìn)行比較。用比色儀測定了啤酒發(fā)酵全過程中顏色的變化（CR-300;日本大阪美能達(dá)有限公司）。測定亨特L（光度）、a（紅度）和b（黃度），并與對照樣品進(jìn)行比較。
用AOAC（官方分析化學(xué)家協(xié)會）方法分析游離氮
（FAN）的變化。為顯色，將1mL顯色試劑與樣品混合，在水浴中加熱16min，冷卻至20=1C。加入5mL碘酸鉀稀釋液，在570nm處測定吸光度。該程序重復(fù)了3次，計算了的含量如下：（mg/L）=試驗(yàn)溶液的凈吸光度值x2x稀釋/標(biāo)準(zhǔn)溶液的凈吸光度值。
用測壓儀（211-DK-12;Dackwang）測定了酒精性啤酒的酒精含量，并用食品標(biāo)準(zhǔn)法中的方法計算。將最終醇含量與對照樣品進(jìn)行比較。[5]
用ASBC法測定苦味度。將10mL 20'C脫碳啤酒轉(zhuǎn)移到離心管中，加入0.5mL 6NHCl和20mL異辛烷。密封搖管（250rpm，15min），離心（1036×3min）。在275nm處測得含有異辛烷的上清液，并測定了溶液的吸光度?？辔队嬎闳缦拢?/p>
苦味=50×Absorbance值，用紫外分光光度計測定啤酒的濁度，如果700nm的吸光度值是430nm的0.039倍，則將啤酒視為“混濁”;否則，將啤酒視為“不混濁”。用ASBC法測定了啤酒的泡沫穩(wěn)定性。將50mL的樣品放入泡沫漏斗中，放置230s，對泡沫（B）和剩余泡沫（C）的體積進(jìn)行分析。
雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)曲線泡沫穩(wěn)定性計算如下：
E=230/2.303 log（b+c）cj
其中E是泡沫穩(wěn)定性。
用ASBC法分析雙乙酰含量。將100mL啤酒蒸餾，制得50mL的去二苯乙烯，再加入5mL的去二苯乙烯水。將5mL ALI轉(zhuǎn)至A10mL容量瓶中，加入1mlα-萘酚溶液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)。加入0.5mL的KOH-肌酸溶液后，搖勻1min，室溫下放置5min，在530nm處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算吸收值。采用方差分析（ANOVA）和統(tǒng)計分析軟件SPSS，對平均值的差異進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用Duncan的多重比較檢驗(yàn)方法進(jìn)一步分析樣本間的顯著性差異。[6]
3 結(jié)果和討論
麥汁的比重穩(wěn)定下降，說明酒精的產(chǎn)生，兩種啤酒的比重相似，對照的比重為1.039，酶處理樣品的比重分別為1.038、1.038和1.039。大香對照為1.040，酶處理樣品分別為1.041、1.041和1.038。經(jīng)二次發(fā)酵后，最終比重均為1.008，但添加10ppm的樣品除外。該樣品的值略低于其它樣品。但差異無顯著性（P>0.05）。
對照樣品和酶處理樣品的比重與報道值基本一致。因此，酶的添加對酒精發(fā)酵沒有負(fù)面影響。
酵母活力在發(fā)酵過程中的生理和活性，對于獲得高質(zhì)量的啤酒是非常重要的。酵母活力的結(jié)果，確定啤酒酵母的最佳投遞率為5×106細(xì)胞/mL。對照樣品在初級發(fā)酵過程中，酵母的生長增加了2.02個對數(shù)細(xì)胞/mL，與酶處理樣品的生長結(jié)果一致。在二次發(fā)酵過程中，酵母的生長分別增加了2.08和1.79log/mL。同樣，酶處理樣品也顯示了相似的結(jié)果。不同品種中酵母生長的差異似乎受酵母生長所需的蛋白質(zhì)和碳水化合物含量的影響。[7]
苦味是啤酒的關(guān)鍵品質(zhì)參數(shù)，由啤酒花的茶酸決定。它們在麥汁煮沸過程中被異構(gòu)化，并傳遞啤酒的重要風(fēng)味化合物。標(biāo)準(zhǔn)苦味范圍為10～40BU（苦味單位），所有樣品的比值均在此標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。
酵母與蛋白質(zhì)-多酚相互作用導(dǎo)致混濁，這可以是參數(shù)提供效率。所有的樣品都顯示出渾濁，因此證實(shí)了發(fā)酵所處的位置。啤酒的泡沫穩(wěn)定性依賴于許多組分的相互作用，如啤酒花等酸、蛋白質(zhì)、金屬離子和氣體組成。
麥汁中的纈草堿缺乏會導(dǎo)致雙乙酰水平升高。由于酵母在谷氨酰胺存在時會使其它氮源代謝，因此氨基酸如丙戊酸被認(rèn)為是重要的氨基酸。因?yàn)榘被釙绊戨p乙酰含量，所以它們的含量是很重要的。
經(jīng)ALDC處理后，雙乙酰含量下降。啤酒A雙乙酰含量由5.17降至131ppm，啤酒B含量由9.75降至1.54ppm。結(jié)果表明，與對照相比，雙乙酰含量分別降低了25%和15%。商品啤酒的雙乙酰水平為0.33mg/L，而微型啤酒廠和釀酒廠的平均雙乙酰水平超過1.0mg/L（39）。由于啤酒都是微調(diào)釀造的，所以雙乙酰含量是相當(dāng)高的。
4 結(jié)束語
總之，ALDC處理明顯降低了啤酒發(fā)酵產(chǎn)生的雙乙酰含量，在不影響啤酒質(zhì)量的前提下縮短了發(fā)酵時間。另外，酶對降低雙乙酰含量有明顯效果，酶的加入對規(guī)?；【瓢l(fā)酵也具有很大的潛力。
參考文獻(xiàn)：
[1]劉會靈，劉栓英，潘龍澤，等.轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ALsR表達(dá)強(qiáng)度對枯草芽孢桿菌合成乙偶姻和2，3-丁二醇的影響[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2020，26（04）：753-759.
[2]劉文娟，黃守鋒，葛菁萍.枯草芽孢桿菌α-乙酰乳酸脫羧酶基因（alsD）的克隆和生物信息學(xué)分析[J].中國農(nóng)學(xué)通報，2019，35（21）：96-102.
[3]趙晨曉.甲基轉(zhuǎn)移酶、精氨酸脫氨酶及乙酰乳酸脫羧酶的催化機(jī)理研究[D].山東大學(xué)，2017.
[4]王長麗，孫雯，黃守鋒，等.產(chǎn)酸克雷伯氏菌（K.oxytoca）α-乙酰乳酸脫羧酶基因（BudA）的克隆及生物信息學(xué)分析[J].黑龍江大學(xué)自然科學(xué)學(xué)報，2016，33（06）：795-801.
[5]王春.磁性納米微球的制備以及其應(yīng)用在α-乙酰乳酸脫羧酶的固定[D].大連工業(yè)大學(xué)，2015.
[6]李浩.固相萃取-高效液相色譜法測定α-乙酰乳酸脫羧酶中四環(huán)素殘留量[J].食品與發(fā)酵科技，2015，51（01）：91-95.
[7]王利.α-乙酰乳酸脫羧酶基因過表達(dá)和敲除的K.pneumoniae代謝特性分析[D].大連理工大學(xué)，2012.
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關(guān)鍵詞：a-乙酰乳酸脫羧酶（ALDC）;釀酒;雙乙酰控制效果;研究
中圖分類號：O657? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? ? ? ?文章編號：2095-2945（2020）30-0066-02
Abstract： The effect of α-acetolactate decarboxylase （ALDC） on the content of diacetyl in beer was studied. ALDC is known to
reduce diacetyl by bypassing the diacetyl formation pathway. Here， beer is brewed under the condition of adding ALDC. Free amino nitrogen （such as valine） has the opposite effect on the formation of diacetyl. The ALDC of 0.02， 0.04， and 0.06 unit/mL was added to the sample and the physical and chemical properties of the beer were analyzed to determine the quality of the beer. The content of diacetyl decreased with the increase of enzyme concentration. The diacetyl content in the sample was reduced by 25% and 15% respectively， and the product quality was greatly improved.
Keywords： α-acetolactate decarboxylase （ALDC）; wine making; diacetyl control effect; study
引言
雙乙酰是一種風(fēng)味化合物，由微生物代謝而成，存在于葡萄酒、奶酪和啤酒等發(fā)酵食品中。然而，啤酒中雙乙酰的存在是不可取的，因?yàn)樗狞S油味道。啤酒中雙乙酰的閾值為0.1～0.15μg/mL，采用多種方法對其進(jìn)行降低或消除。可通過使用不同菌株的投料酵母、控制投料率、在麥汁中添加纈草堿或控制麥芽汁的含量來控制麥汁的含量。
1 調(diào)節(jié)氨基酸與發(fā)酵糖的比例
a-乙酰乳酸被細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)化為valine或排泄，并通過非常慢的非酶反應(yīng)（13）而脫羧為雙乙酰。通過雙乙酰休息，少量的剩余酵母再吸收蟲草中的雙乙酰，并通過酵母還原酶將其還原為風(fēng)味較弱的乙酰丙酮和丁二醇。然而，At-乙酰乳酸脫羧酶（ALDC）是由一株改良的枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilisis）生產(chǎn)的酶，不存在于瀝青酵母中，它可以繞過雙乙酰生成或減少雙乙酰生成，直接將α-乙酰乳酸轉(zhuǎn)化為乙酰丙酮。本研究采用ALDC對啤酒中的雙乙酰進(jìn)行還原，并與傳統(tǒng)的陳釀啤酒進(jìn)行了比較。[2]此外，還研究了在酶存在下對啤酒質(zhì)量的影響。
2 材料和方法
所使用的投球酵母是Hefeweizenale酵母WLP 300。采用傳統(tǒng)顆粒型啤酒花，a-酸含量為10%。麥芽自動微麥芽系統(tǒng)被用于格式化（浸泡，發(fā)芽和燒制）。在15℃下用濕式浸泡和干式浸泡進(jìn)行浸泡，重復(fù)三次。[3]在16%C下發(fā)芽5d，然后拔除根部。在45℃下燒制30min，溫度提高5℃/min，最終溫度達(dá)到65℃，然后迅速提高到80℃（18℃），麥芽用滾筒磨在1mm的間隙。采用糊化法進(jìn)行糖化。在45℃下，將50克砂礫與200mL蒸餾水混合，在45%C下攪拌30 min，然后將溫度提高1℃/min，直至終溫達(dá)到70℃。加入熱蒸餾水（70℃），在相同溫度下繼續(xù)攪拌1h。麥汁在20℃快速冷卻，加入蒸餾水調(diào)節(jié)到450g，麥汁過濾采用濾紙過濾。麥汁用間歇性添加的啤酒花煮熟（占總量的一半，10分鐘，1/4，5分鐘和1/4，5分鐘），然后在冰上快速冷卻。初始比重法測定酒精含量和糖化度，添加酵母（約6個對數(shù)細(xì)胞/mL）和0.02，0.04，0.06單位/mL ALDC，在20%C下進(jìn)行初級發(fā)酵4天。將啤酒轉(zhuǎn)瓶后，在15%C條件下進(jìn)行二次發(fā)酵7天，以酶產(chǎn)生量1mmol/min確定為ALDC活性單位。使用比重計測定了比重。在初級發(fā)酵結(jié)束和二次發(fā)酵結(jié)束時，比較了樣品的比重和對照值的變化。分析酵母活力，活細(xì)胞（對數(shù)細(xì)胞/mL）還原亞甲基藍(lán)。[4]
為了變白，使用血細(xì)胞計（Marienfeld-Superior，Lauda-K nigshofen，德國）。第一次發(fā)酵和二次發(fā)酵分別進(jìn)行4天和7天的Viablecell計數(shù)，并與未用酶處理的對照樣品進(jìn)行比較。用比色儀測定了啤酒發(fā)酵全過程中顏色的變化（CR-300;日本大阪美能達(dá)有限公司）。測定亨特L（光度）、a（紅度）和b（黃度），并與對照樣品進(jìn)行比較。
用AOAC（官方分析化學(xué)家協(xié)會）方法分析游離氮
（FAN）的變化。為顯色，將1mL顯色試劑與樣品混合，在水浴中加熱16min，冷卻至20=1C。加入5mL碘酸鉀稀釋液，在570nm處測定吸光度。該程序重復(fù)了3次，計算了的含量如下：（mg/L）=試驗(yàn)溶液的凈吸光度值x2x稀釋/標(biāo)準(zhǔn)溶液的凈吸光度值。
用測壓儀（211-DK-12;Dackwang）測定了酒精性啤酒的酒精含量，并用食品標(biāo)準(zhǔn)法中的方法計算。將最終醇含量與對照樣品進(jìn)行比較。[5]
用ASBC法測定苦味度。將10mL 20'C脫碳啤酒轉(zhuǎn)移到離心管中，加入0.5mL 6NHCl和20mL異辛烷。密封搖管（250rpm，15min），離心（1036×3min）。在275nm處測得含有異辛烷的上清液，并測定了溶液的吸光度?？辔队嬎闳缦拢?/p>
苦味=50×Absorbance值，用紫外分光光度計測定啤酒的濁度，如果700nm的吸光度值是430nm的0.039倍，則將啤酒視為“混濁”;否則，將啤酒視為“不混濁”。用ASBC法測定了啤酒的泡沫穩(wěn)定性。將50mL的樣品放入泡沫漏斗中，放置230s，對泡沫（B）和剩余泡沫（C）的體積進(jìn)行分析。
雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)曲線泡沫穩(wěn)定性計算如下：
E=230/2.303 log（b+c）cj
其中E是泡沫穩(wěn)定性。
用ASBC法分析雙乙酰含量。將100mL啤酒蒸餾，制得50mL的去二苯乙烯，再加入5mL的去二苯乙烯水。將5mL ALI轉(zhuǎn)至A10mL容量瓶中，加入1mlα-萘酚溶液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)。加入0.5mL的KOH-肌酸溶液后，搖勻1min，室溫下放置5min，在530nm處測定吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算吸收值。采用方差分析（ANOVA）和統(tǒng)計分析軟件SPSS，對平均值的差異進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用Duncan的多重比較檢驗(yàn)方法進(jìn)一步分析樣本間的顯著性差異。[6]
3 結(jié)果和討論
麥汁的比重穩(wěn)定下降，說明酒精的產(chǎn)生，兩種啤酒的比重相似，對照的比重為1.039，酶處理樣品的比重分別為1.038、1.038和1.039。大香對照為1.040，酶處理樣品分別為1.041、1.041和1.038。經(jīng)二次發(fā)酵后，最終比重均為1.008，但添加10ppm的樣品除外。該樣品的值略低于其它樣品。但差異無顯著性（P>0.05）。
對照樣品和酶處理樣品的比重與報道值基本一致。因此，酶的添加對酒精發(fā)酵沒有負(fù)面影響。
酵母活力在發(fā)酵過程中的生理和活性，對于獲得高質(zhì)量的啤酒是非常重要的。酵母活力的結(jié)果，確定啤酒酵母的最佳投遞率為5×106細(xì)胞/mL。對照樣品在初級發(fā)酵過程中，酵母的生長增加了2.02個對數(shù)細(xì)胞/mL，與酶處理樣品的生長結(jié)果一致。在二次發(fā)酵過程中，酵母的生長分別增加了2.08和1.79log/mL。同樣，酶處理樣品也顯示了相似的結(jié)果。不同品種中酵母生長的差異似乎受酵母生長所需的蛋白質(zhì)和碳水化合物含量的影響。[7]
苦味是啤酒的關(guān)鍵品質(zhì)參數(shù)，由啤酒花的茶酸決定。它們在麥汁煮沸過程中被異構(gòu)化，并傳遞啤酒的重要風(fēng)味化合物。標(biāo)準(zhǔn)苦味范圍為10～40BU（苦味單位），所有樣品的比值均在此標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。
酵母與蛋白質(zhì)-多酚相互作用導(dǎo)致混濁，這可以是參數(shù)提供效率。所有的樣品都顯示出渾濁，因此證實(shí)了發(fā)酵所處的位置。啤酒的泡沫穩(wěn)定性依賴于許多組分的相互作用，如啤酒花等酸、蛋白質(zhì)、金屬離子和氣體組成。
麥汁中的纈草堿缺乏會導(dǎo)致雙乙酰水平升高。由于酵母在谷氨酰胺存在時會使其它氮源代謝，因此氨基酸如丙戊酸被認(rèn)為是重要的氨基酸。因?yàn)榘被釙绊戨p乙酰含量，所以它們的含量是很重要的。
經(jīng)ALDC處理后，雙乙酰含量下降。啤酒A雙乙酰含量由5.17降至131ppm，啤酒B含量由9.75降至1.54ppm。結(jié)果表明，與對照相比，雙乙酰含量分別降低了25%和15%。商品啤酒的雙乙酰水平為0.33mg/L，而微型啤酒廠和釀酒廠的平均雙乙酰水平超過1.0mg/L（39）。由于啤酒都是微調(diào)釀造的，所以雙乙酰含量是相當(dāng)高的。
4 結(jié)束語
總之，ALDC處理明顯降低了啤酒發(fā)酵產(chǎn)生的雙乙酰含量，在不影響啤酒質(zhì)量的前提下縮短了發(fā)酵時間。另外，酶對降低雙乙酰含量有明顯效果，酶的加入對規(guī)?；【瓢l(fā)酵也具有很大的潛力。
參考文獻(xiàn)：
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