含纈酪肽蛋白促進(jìn)單鏈RNA 和雙鏈DNA 病毒復(fù)制或釋放機(jī)制的研究進(jìn)展

徐娜,桓晨,鄭柏松

（吉林大學(xué)第一醫(yī)院艾滋病與病毒研究所，吉林 長(zhǎng)春 130021）

含纈酪肽蛋白（valosin-containing protein，VCP）又名P97，屬三磷酸腺苷酸酶超家族（ATPases associated with various cellular activities，AAA）成員之一。自1982 年首次從酵母中分離后［1］，VCP先后在多種哺乳動(dòng)物中被發(fā)現(xiàn)［2］。作為一種普遍存在于各種哺乳動(dòng)物細(xì)胞質(zhì)中的蛋白，VCP 在結(jié)構(gòu)上為一種環(huán)狀同源六聚體復(fù)合物［3］。每個(gè)單體包含4 個(gè)結(jié)構(gòu)域：1 個(gè)可移動(dòng)的N 端結(jié)構(gòu)域、2 個(gè)保守的AAA 結(jié)構(gòu)域（稱為D1 和D2）和1 個(gè)無(wú)序的C 端尾部結(jié)構(gòu)域［4-5］。每個(gè)AAA 結(jié)構(gòu)域都包含保守的核苷酸結(jié)合基序和水解基序以及有效水解所必需的第二同源區(qū)域［6-7］。以往研究［8-10］表明：VCP 的核心功能是依賴于其ATPase 活性的泛素化蛋白水解作用，這一功能使得VCP 不僅能夠參與細(xì)胞內(nèi)核酸重建、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體相關(guān)蛋白降解［11-12］、細(xì)胞周期調(diào)控［13-14］、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear transcription factor-κB，NF-κB）活化［15］、膜融合和囊泡運(yùn)輸［16］等重要細(xì)胞活動(dòng)，還具有抗細(xì)胞凋亡和促進(jìn)細(xì)胞增殖及浸潤(rùn)等作用。

近年來(lái)，圍繞VCP 的功能研究已經(jīng)證實(shí)VCP與蛋白穩(wěn)態(tài)失調(diào)相關(guān)疾病及癌癥有關(guān)聯(lián)，其中包括亨廷頓舞蹈病（Huntington’s disease，HD）［17］、雄激素非依賴性前列腺癌（androgen-independent prostate cancer，AIPC）［18］和多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）［19］等。VCP 能有效殺傷癌細(xì)胞，可能是一種廣泛的抗腫瘤因子。隨著研究的深入，VCP 與感染性疾病的聯(lián)系愈加緊密，其作為宿主因子參與病毒相關(guān)的感染性疾病的研究已受到廣泛關(guān)注。目前，圍繞VCP 研究的綜述主要在2 個(gè)方面：一方面是圍繞VCP 介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解及其機(jī)制，包括蛋白酶體降解、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解（endoplasmic reticulum-associated degradation，ERAD）和自噬［14］；另一方面是關(guān)于VCP參與DNA 復(fù)制和染色質(zhì)動(dòng)力學(xué)等細(xì)胞周期的調(diào)控和機(jī)制研究［13，20］。目前，關(guān)于VCP 參與的ERAD 相關(guān)的蛋白降解途徑的研究較為深入。盡管VCP 借助蛋白質(zhì)降解和DNA 調(diào)控等功能參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展，但未見(jiàn)針對(duì)VCP 作為宿主因子在病毒性疾病中的作用及其分子機(jī)制方面的報(bào)道。現(xiàn)針對(duì)近年來(lái)報(bào)道的VCP 同多種病毒在人體內(nèi)的復(fù)制或釋放的相關(guān)研究進(jìn)行綜述（表1），為病毒感染性疾病的診治提供參考。

1 VCP 參與單股正鏈RNA 病毒的復(fù)制

在修飾的宿主細(xì)胞內(nèi)膜上組裝病毒復(fù)制酶以形成復(fù)制復(fù)合物（replication complex，RC）是幾乎所有正鏈RNA 病毒成功復(fù)制的標(biāo)志［21］。VCP 與單鏈RNA 病毒的復(fù)制有關(guān)聯(lián)，其中包括西尼羅河病毒（West Nile virus，WNV）［22］、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）［23］、脊髓灰質(zhì)炎病毒（poliovirus，PV）［24］、腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）［25］、冠狀病毒（coronavirus，CoV）［26］、辛德畢斯病毒（Sindbis virus，SINV）［27］和基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）［28］。

1.1 VCP 參與黃病毒科黃病毒屬病毒成員的復(fù)制WNV 和HCV 均是黃病毒科黃病毒屬的成員，屬于有包膜結(jié)構(gòu)的單股正鏈RNA 病毒［22-23］。WNV主要導(dǎo)致西尼羅河腦炎，HCV 主要引起丙型肝炎。PHONGPHAEW 等［29］研究發(fā)現(xiàn)：在HeLa 細(xì)胞中使用VCP 抑制劑或siRNA 抑制內(nèi)源性VCP 表達(dá)后，WNV 病毒感染能力及RNA 表達(dá)水平明顯降低，表明VCP 可能在WNV 病毒生命周期的吸附或進(jìn)入的早期步驟中起作用。該研究通過(guò)構(gòu)建WNV 病毒樣顆粒和基于WNV-DNA 的復(fù)制子，證明VCP 參與合成新的WNV 病毒基因組并介導(dǎo)WNV 病毒復(fù)制［29］。研究［30］發(fā)現(xiàn)：在Huh7.5 細(xì)胞中利用分子生物學(xué)技術(shù)敲除VCP 或加入VCP 生理抑制劑EerI 和NMS-873 后，能夠降低HCV 病毒的復(fù)制水平。在此過(guò)程中，VCP 通過(guò)與HCV 病毒的一種無(wú)酶活性的多功能非結(jié)構(gòu)蛋白NS5A DI 相互作用，達(dá)到參與HCV 病毒復(fù)制的目的。VCP 表達(dá)受抑制后，促使HCV NS5A 聚集并減少NS5A 的高度磷酸化，影響HCV 病毒復(fù)制酶的組裝，進(jìn)而影響復(fù)制復(fù)合物的形成［30-31］，最終影響HCV 病毒的復(fù)制。綜上所述，在HCV 復(fù)制過(guò)程中，VCP 發(fā)揮解聚作用，利用腺苷三磷酸酶（ATPase）酶活性（氨基酸位點(diǎn)：241～647 位）防止HCV NS5A 聚集，幫助HCV 病毒復(fù)制。

1.2 VCP 參與小核糖核酸病毒科腸道病毒屬病毒成員的復(fù)制PV 和EV71 同屬于小核糖核酸病毒科腸道病毒屬成員，是無(wú)包膜結(jié)構(gòu)的單股正鏈RNA 病毒［24-25］。PV 主要引起脊髓灰質(zhì)炎，EV71是導(dǎo)致手足口病的重要病原體之一。ARITA 等［24］針對(duì)膜轉(zhuǎn)運(yùn)基因?qū)V 病毒復(fù)制所需的宿主因子進(jìn)行小干擾RNA（siRNA）篩選，發(fā)現(xiàn)VCP 與PV病毒復(fù)制有關(guān)。為了確定VCP 與PV 病毒復(fù)制相關(guān)的主要活性位點(diǎn)，研究者對(duì)VCP ATPase 活性位點(diǎn)進(jìn)行點(diǎn)突變［32］，獲得K524A 失活突變體和R191Q及A232E 活性增強(qiáng)突變體。通過(guò)在沉默VCP 的HEK293T 細(xì)胞中過(guò)表達(dá)野生型VCP 和2 種突變體VCP［32］，結(jié)果顯示：與轉(zhuǎn)染了野生型和活性增強(qiáng)突變體VCP 的細(xì)胞比較，PV 病毒在轉(zhuǎn)染K524A失活突變體細(xì)胞中的復(fù)制能力明顯降低，表明VCP 的ATPase 活性對(duì)于維持PV 病毒的復(fù)制至關(guān)重要。WU 等［33］首次針對(duì)EV71 病毒易感細(xì)胞——橫紋肌肉瘤細(xì)胞（RD）中21 121 個(gè)人類全基因組siRNA 文庫(kù)進(jìn)行了基于免疫熒光的表型篩選，鑒定出促進(jìn) EV71 病毒復(fù)制的因子（host susceptibility factors，HSFs，又稱宿主易感性因子）和抑制EV71 病毒復(fù)制的因子（host resistance factors，HRFs，又稱宿主抗性因子）；最終發(fā)現(xiàn)可能參與EV71 病毒復(fù)制所涉及的256 個(gè)宿主因子，其中宿主抗性因子包含細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑極光激酶B（aurora kinase B，AURKB）和細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶6（cyclin-dependent kinase 6，CDK6），而EV71 可能通過(guò)誘導(dǎo)CDK6 的出核而對(duì)EV71 病毒的復(fù)制進(jìn)行調(diào)節(jié)。另外，ERAD 成分N-聚糖酶1（N-glycanase 1，NGLY1）和VCP 被證明是EV71宿主易感因子，能夠在特定的細(xì)胞周期階段促進(jìn)EV71 的復(fù)制。WANG 等［34］通過(guò)探討EV71 病毒感染過(guò)程中ERAD 底物的變化發(fā)現(xiàn)：EV71 病毒感染能夠通過(guò)多重位點(diǎn)——HES 相關(guān)抑制蛋白（hes-related repressor protein，Herp）、羥甲基戊二酰輔酶A 還原酶降解蛋白1（Hmg-Co A reductase degradation 1，Hrd1）、E2 泛素結(jié)合酶（E2 ubiquitin-conjugating enzymes，Ubc6e）、VCP 相關(guān)膜蛋白（VCP-interacting membrane protein，VIMP）和泛素調(diào)節(jié)X 結(jié)構(gòu)域的膜蛋白8（ubiquitin regulatory X domain-containing protein 8，UBXD8）將ERAD 底物錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，VCP 能夠促進(jìn)EV71 病毒的復(fù)制。其中，EV71 3C 蛋白能夠在Q219G、Q260S 和Q273G 3 個(gè)位點(diǎn)［35］處切割E2泛素結(jié)合酶Ubc6e，而EV71 2A 蛋白則抑制Herp和VIMP 的合成，導(dǎo)致ERAD 途徑受到抑制。其中，VIMP 是一種與VCP 具有相互作用的膜蛋白［36］，能夠招募VCP 和其他輔助因子至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［37］。免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)［34］表明：VCP ATPase 活性區(qū)域能夠與EV71 病毒相結(jié)合，而且VCP 能與EV71 2C 蛋白在復(fù)制復(fù)合物中發(fā)生共定位，致使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜發(fā)生重塑，促進(jìn)EV71 病毒的復(fù)制。VCP 并不能作用于腸道病毒屬柯薩奇病毒 B3（coxsackievirus B3，CVB3）的復(fù)制［24］，表明VCP對(duì)腸道病毒屬病毒的促進(jìn)作用具有偏好性，有待進(jìn)一步研究。

1.3 VCP 參與CoV 的復(fù)制CoV 是一類有包膜的正鏈RNA 病毒，可在人類和多種哺乳動(dòng)物中引起呼吸道和腸道疾?。?6］。WONG 等［38］以CoV 家族成員之一的傳染性支氣管炎病毒（infectious bronchitis virus，IBV）為模型，發(fā)現(xiàn)VCP 在IBV病毒復(fù)制早期發(fā)揮作用。

1.4 VCP 參與披膜病毒科甲病毒屬病毒的復(fù)制1955 年分離的SINV 和1952 年分離的CHIKV 同屬于披膜病毒科甲病毒屬，是具有囊膜結(jié)構(gòu)的單股正鏈RNA 病毒。VCP 能夠調(diào)節(jié)SINV［27］進(jìn)入受體天然抗性相關(guān)的巨噬細(xì)胞蛋白2（natural resistanceassociated macrophage protein 2，NRAMP2）的運(yùn)輸，在果蠅細(xì)胞中敲除VCP 后，將改變NRAMP2的運(yùn)輸途徑導(dǎo)致NRAMP2 被溶酶體降解和SINV病毒的復(fù)制受到抑制［27］。VCP 在CHIKV 生命周期中的病毒RNA 復(fù)制中起作用［28］，但不影響CHIKVA 病毒的吸附或進(jìn)入。

2 VCP 促進(jìn)雙鏈DNA 病毒的復(fù)制

盡管VCP 參與多種單鏈RNA 病毒的復(fù)制，但截止目前為止VCP 同DNA 病毒相互關(guān)系的研究鮮有報(bào)道。加州苜蓿多核核型多角體病毒（autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus，AcMNPV）屬于昆蟲(chóng)細(xì)胞桿狀病毒，是一種雙鏈DNA 病毒。LYUPINA 等［39］發(fā)現(xiàn)：利用藥物NMS-873 抑制VCP 可阻斷桿狀病毒AcMNPV 的感染周期，導(dǎo)致芽狀病毒粒子產(chǎn)生受到抑制，并且VCP 通過(guò)其ATPase 活性參與泛素-蛋白酶體途徑，促進(jìn)AcMNPV 病毒的復(fù)制。

人類巨細(xì)胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV）作為一種感染人類的雙鏈DNA 病毒，是皰疹病毒家族中基因組最大的成員，先天性感染在HCMV 病毒感染中占據(jù)較高比例［40］。HCMV 的早期蛋白質(zhì)IE1 和IE2 是HCMV 復(fù)制的關(guān)鍵，能夠平衡激活感染和潛伏感染。LIN 等［41］敲除VCP 后導(dǎo)致IE2 表達(dá)丟失，表明VCP 是HCMV 蛋白IE2 表達(dá)所必需的。RNAseq 分析［41］顯示：敲除VCP后，IE1 剪接水平增加，IE2 剪接水平相應(yīng)減少。病毒轉(zhuǎn)錄的整體分析顯示：盡管IE2 表達(dá)丟失，但包括UL112/113 在內(nèi)的病毒基因的子集表達(dá)水平并未降低，表明VCP 敲低引起的IE1 和IE2 水平變化不是病毒復(fù)制延遲所導(dǎo)致。免疫熒光實(shí)驗(yàn)研究［41］結(jié)果顯示：VCP 與細(xì)胞核中的病毒復(fù)制區(qū)具有共定位，進(jìn)一步表明VCP 對(duì)于HCMV 的復(fù)制具有重要意義。

3 VCP 參與病毒粒子的釋放

除影響病毒復(fù)制外，VCP 與病毒粒子釋放相關(guān)。裂谷熱病毒（rift valley fever virus，RVFV）屬于布尼亞病毒目白纖病毒科白蛉病毒屬，RVFV病毒是裂谷熱（rift valley fever，RVF）的病原體，RVF 是一種人畜共患病毒，可導(dǎo)致人畜共患病［42］。BRAHMS 等［43］研究發(fā)現(xiàn)：在分泌途徑中涉及膜重塑功能的VCP 對(duì)RVFV 病毒的釋放很重要；Vero 細(xì)胞中敲除VCP 后導(dǎo)致RVFV 病毒復(fù)制減少，且RVFV 病毒糖蛋白Gn 與高爾基復(fù)合體定位減少，而在ER 的積累增加；在用靶向VCP 的siRNA 轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中也觀察到RVFV 病毒粒子在細(xì)胞內(nèi)的積累。該研究結(jié)果提示：siVCP 后RVFV病毒粒子的組裝發(fā)生在高爾基體中，但在組裝后將其錨定至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)來(lái)阻止病毒粒子釋放。

在關(guān)于PV 病毒的研究中，ARITA 等［24］通過(guò)在PV 病毒感染的RD 細(xì)胞和HEK293T 細(xì)胞中進(jìn)行VCP 與病毒蛋白共定位及相互作用分析發(fā)現(xiàn)：VCP 與PV-2BC/2C 蛋白和3AB/3B 蛋白存在共定位情況，鄰位連接作用（proximity ligation assay，PLA）分析顯示VCP 與2BC 和3AB 蛋白相互作用，但不與2C 蛋白和3A 蛋白相互作用；敲除VCP 后，PV 病毒蛋白表達(dá)相應(yīng)減少。該研究發(fā)現(xiàn)了細(xì)胞蛋白分泌與病毒RNA 復(fù)制之間的新型聯(lián)系。

表1 VCP 與單鏈RNA 和雙鏈DNA 病毒關(guān)系Tab.1 Relationships between VCP and single-stranded RNA and double-stranded DNA viruses

4 總結(jié)與展望

目前，VCP 不僅可以通過(guò)參與病毒復(fù)制體的組裝實(shí)現(xiàn)促進(jìn)病毒基因復(fù)制的作用，還可以通過(guò)膜重塑功能參與病毒粒子的釋放。VCP 不參與負(fù)鏈RNA 病毒水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）的生命活動(dòng)。目前針對(duì)VCP 與單股正鏈RNA 病毒的研究較多，其中VCP 對(duì)腸道病毒屬PV 和EV71 均能有效的促進(jìn)病毒復(fù)制，但不影響CVB3 病毒的復(fù)制，表明不同腸道病毒的致病機(jī)制不同。針對(duì)VCP 參與正鏈RNA 病毒W(wǎng)NV、HCV、PV、EV71、CoV、SINV、CHIKV 和RVFV 病毒生命周期的廣譜性，以及對(duì)于DNA 病毒AcMNPV、皰疹病毒HCMV 特異的促進(jìn)作用及依據(jù)VCP 能夠有效調(diào)控ERAD 和自噬等相關(guān)途徑的特點(diǎn)，將有助于設(shè)計(jì)新的抗病毒藥物，為感染性疾病的診治提供新的思路。