木槿皮提取物的揮發(fā)性成分分析及抑菌性研究

楊靖，王瓊波，費嘉祥，楊鵬飛，劉宛凌,李天笑，白冰，毛多斌

(1.鄭州輕工業(yè)大學 食品與生物工程學院，鄭州 450002；2.漯河醫(yī)學高等?？茖W校 食品營養(yǎng)系，河南 漯河 462002；3.河南中煙工業(yè)有限責任公司許昌卷煙廠，河南 許昌 461000)

作為一類天然安全的抑菌劑和抗氧化劑，植物提取物在日常的食品保鮮中具有非常廣闊的應用前景[1-3]。木槿(HibiscussyriacusL.)，為錦葵科木槿屬植物，是一種傳統(tǒng)的中草藥，其花、葉、皮均可入藥，在中國和韓國已有數(shù)百年的使用歷史[4]，目前，國內(nèi)外對木槿的研究主要集中在花和葉上。金月亭等[5]發(fā)現(xiàn)木槿花提取物具有良好的清除自由基、抗氧化能力和抑菌能力。黃采姣等[6]研究發(fā)現(xiàn)木槿花的抗氧化活性與其多酚和總黃酮含量間有極顯著的相關性，并從木槿花正丁醇萃取物中初步鑒定出8種抗氧化物質(zhì)。耿明江等[7]、張婕等[8]采用乙醇對木槿花醇溶性色素進行提取并研究其清除超氧自由基的活性。楊少宗等[9]發(fā)現(xiàn)來自浙江蒼南和龍泉的紫花重瓣木槿營養(yǎng)價值較高，具有較高的開發(fā)利用價值。楊濤等[10]對木槿葉中總酚的提取工藝及抗氧化作用進行了研究。陳磊等[11]對木槿葉總黃酮提取工藝及其抗氧化活性進行了研究。Punasiya等[12-14]研究發(fā)現(xiàn)木槿葉不同溶劑提取物的抗氧化效力與抗壞血酸非常接近，其中甲醇提取物中的類黃酮含量最高，具有較強的抗菌活性，對蠟狀芽孢桿菌、表皮葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和枯草芽孢桿菌具有明顯的抑制作用。Jang等[15]發(fā)現(xiàn)木槿皮的熱水和70%乙醇提取物對革蘭氏陰性細菌和大腸桿菌均有抑制作用，其抑制性與提取物濃度成正比。Kwon等[16]指出木槿根皮提取物具有抗氧化性，且木槿根皮提取物熱處理后清除自由基的活性顯著增加。但木槿皮的揮發(fā)性化學成分及抑菌性的研究卻鮮有報道。本文以無水乙醇為溶劑采用超聲波輔助提取技術(shù)對木槿皮進行提取[17，18]，采用GC×GC-Q-TOFMS分析提取物的化學成分，并對其抑菌性進行研究，為木槿皮的進一步開發(fā)利用提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木槿皮：市售，北京同仁堂；大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、地衣芽孢桿菌、高地芽孢桿菌、糞腸球菌、肺炎克雷伯氏菌：以上菌種均由鄭州輕工業(yè)大學微生物實驗室提供。

1.2 儀器與設備

7200/7890B GC×GC-Q-TOFMS 美國安捷倫科技公司；SSM01固態(tài)調(diào)制器 上海雪景科技有限公司；KQ2200B型超聲波提取裝置 昆山市超聲儀器有限公司；LA-230S型電子天平(感量0.001 g) 北京賽多利斯儀器有限公司；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 木槿皮的提取

將干燥的木槿皮粉碎稱重，放入500 mL三角瓶中，加入適量的無水乙醇，置于超聲波提取裝置中，選擇在不同的液料比、粉碎度、提取溫度、提取時間下萃取，萃取完成后取出三角瓶，抽濾，濾液在低溫條件下旋蒸除去乙醇獲得木槿皮提取物。

1.3.2 分析條件

1.3.2.1 GC×GC-TOFMS色譜條件

柱1：HP-5MS(Agilent Scientific，60 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱2：DB-17(Agilent Scientific，1.2 m×0.18 mm×0.25 μm)，兩根色譜柱以串聯(lián)方式連接，調(diào)制周期4 s。進樣口溫度280 ℃，載氣He，載氣流速1.5 mL/min。程序升溫條件：起始溫度50 ℃，保留5 min，以4 ℃/min升溫到270 ℃，保留3 min，進樣量1 μL，分流比100∶1，掃描頻率50 Hz，掃描離子范圍(m/z)：50～500 u。

1.3.2.2 質(zhì)譜條件

四級桿溫度：150 ℃；離子源溫度(EI)：280 ℃；檢測器電壓：1700 V；電離能量：70 eV；傳輸線溫度：230 ℃。

1.3.2.3 揮發(fā)性物質(zhì)的定性分析

全二維數(shù)據(jù)處理采用Canvas公司的軟件(Version 2.0)，自動識別信噪比大于30的峰，采用NIST 02質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫鑒定各色譜峰的化學成分，采用面積歸一化法測定各成分的相對含量。

1.3.3 抑菌性試驗

稱取25 g肉湯培養(yǎng)基、18 g瓊脂，加入1000 mL蒸餾水，加熱溶解后分裝，于121 ℃高壓滅菌15 min，備用。用于大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌等的培養(yǎng)和抑菌試驗。

采用倍比稀釋法在96孔板中測定最小抑菌濃度(MIC)[19]。在MIC測定試驗中，從無菌生長的液體培養(yǎng)基中取出20 mL涂布平板，繼續(xù)培養(yǎng)(37 ℃/24 h)，觀察有無菌落生長。無菌落生長的最小濃度即為最小殺菌濃度(MBC)。MIC試驗中，為了保證提取物與培養(yǎng)液的互溶性，需在培養(yǎng)液中加入1%(V/V)的吐溫80做乳化劑。

2 試驗結(jié)果

2.1 液料比對提取率的影響

準確稱取40目的木槿皮粉末10 g，分別按照液料比5∶1、8∶1、10∶1、12∶1、15∶1的比例加入無水乙醇，在25 ℃的條件下超聲萃取15 min，木槿皮的提取率見圖1。

圖1 液料比對產(chǎn)率的影響Fig.1 Effect of ratio of liquid to solid on yield of Hibiscus syriacus L.

由圖1可知，木槿皮提取率隨液體比例增大而提高，當液料比為12∶1時，木槿皮提取率最高，繼續(xù)增加溶劑的量，提取效率略有降低，可能是因為溶劑過量會造成超聲作用不完全，不能將所有的細胞壁震破，而導致提取率偏低。

2.2 粉碎度對提取率的影響

分別準確稱取20，40，60，80，100目木槿皮粉末10 g，按照液料比10∶1加入無水乙醇，在25 ℃的條件下超聲萃取15 min，木槿皮的提取率見圖2。

圖2 粉碎度對產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of crushing particle size on yield of Hibiscus syriacus L.

由圖2可知，木槿皮的提取率隨著粉碎度的增加呈上升趨勢，這主要是由于粉碎度越大，萃取溶劑的接觸面就越大，木槿皮中的有效成分就越容易被提取出來。

2.3 時間對提取率的影響

準確稱取40目的木槿皮粉末10 g，按照液料比10∶1加入無水乙醇，在25 ℃的條件下分別超聲萃取10，15，20，25，30 min，木槿皮的提取率見圖3。

圖3 時間對產(chǎn)率的影響Fig.3 Effect of time on yield of Hibiscus syriacus L.

由圖3可知，木槿皮的提取率隨著時間的延長呈上升趨勢，當超聲時間超過25 min后，木槿皮的提取率隨超聲時間的繼續(xù)延長增加很少，這主要是由于木槿皮中的有效成分在25 min時基本都被提取出來。

2.4 溫度對提取率的影響

準確稱取40目的木槿皮粉末10 g，按照液料比10∶1加入無水乙醇，分別在20，25，30，35，40 ℃的條件下超聲萃取15 min，木槿皮的提取率見圖4。

圖4 溫度對產(chǎn)率的影響Fig.4 Effect of temperature on yield of Hibiscus syriacus L.

由圖4可知，木槿皮的提取率隨著溫度的升高呈增加趨勢，當超聲溫度超過35 ℃后，木槿皮的提取率隨溫度的升高反而降低，這可能是由于萃取溫度逐漸上升，木槿皮中的一些低沸點成分易揮發(fā)，所以提取率略有下降。

2.5 正交試驗

綜合單因素試驗結(jié)果，對影響超聲波萃取的主要因素進行了四因素四水平試驗，試驗因素及水平見表1，試驗結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表1 試驗因素及水平Table 1 The factors and levels of orthogonal experiment

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 The orthogonal experimental results

表3 方差分析表Table 3 Variance analysis table

由表2可知，影響因素大小順序為：目數(shù)>提取時間>液料比>提取溫度，最佳提取條件為：粉碎度100目，提取時間30 min，液料比15，提取溫度40 ℃。

由表3可知，目數(shù)和提取時間為極顯著影響因子，液料比為顯著影響因子，提取溫度為不顯著影響因子。

2.6 揮發(fā)性成分分析

木槿皮提取物采用GC×GC-Q-TOFMS分析，所得全二維色譜圖見圖5，以計算機檢索譜庫確定化合物，以質(zhì)譜離子峰面積百分數(shù)表示各成分含量，分析結(jié)果見表4。

圖5 木槿皮提取物全二維色譜圖Fig.5 The comprehensive two-dimensional chromatogram of Hibiscus syriacus L. extracts

表4 木槿皮提取物化學成分分析結(jié)果Table 4 The analysis results of chemical components of Hibiscus syriacus L. extracts

續(xù) 表

木槿皮提取物中共鑒定出41種揮發(fā)性成分，占總萃取物的63.78%，其中：酯類12種，酸類7種，烷烴類7種，醇類4種，酮類4種，酚類3種，醚類2種，醛類2種。含量較高的成分是一些酯類和酸類，如：己二酸-(2-乙基己基)酯(21.35%)、亞油酸(6.25%)、油酸(5.70%)和14-甲基十六酸異丙酯(3.67%)。

2.7 抑菌性試驗結(jié)果

木槿皮提取物以及青霉素鈉對7種不同細菌的最小抑菌濃度(MIC)以及最小殺菌濃度(MBC)測定結(jié)果見表5和表6。

表5 木槿皮提取物的最小抑菌濃度(MIC)Table 5 The minimum inhibitory concentration (MIC) of Hibiscus syriacus L. extracts μg/mL

表6 木槿皮提取物的最小殺菌濃度(MBC)Table 6 The minimum bactericidal concentration (MBC) of Hibiscus syriacus L. extracts μg/mL

由表5和表6可知，木槿皮提取物對7種細菌都具有一定的抑菌和殺菌能力，其中對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和高地芽孢桿菌的抑菌效果較好，對糞腸球菌和地衣芽孢桿菌的抑菌能力相對較差；木槿皮提取物對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和高地芽孢桿菌的殺菌效果相對較好，最小殺菌濃度(MBC)為500 μg/mL，對其他4種細菌的殺菌效果相對較差，最小殺菌濃度為1000 μg/mL。主要原因是木槿皮中含有的一些類黃酮、三萜類化合物和糖苷類化合物已被證實具有抗菌性，這些化合物易于被乙醇萃取出來，同時木槿皮提取物中含有的異丁香酚(0.19%)、丹皮酚(0.11%)和肉豆蔻醚(0.03%)也具有一定的抑菌作用。

3 討論

揮發(fā)油是植物中重要的次級代謝產(chǎn)物，本研究從木槿皮提取物中共鑒定出41種揮發(fā)性成分，占總萃取物的63.78%，含量較高的成分是一些酯類和酸類如：己二酸-(2-乙基己基)酯(21.35%)、亞油酸(6.25%)、油酸(5.70%)和14-甲基十六酸異丙酯(3.67%)。同一植物不同部位提取物的抑菌性存在一定的差異。金月亭采用40%的乙醇浸提木槿花，發(fā)現(xiàn)提取液質(zhì)量濃度為100 mg干花/mL時，對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用較為明顯，質(zhì)量濃度為125 mg干花/mL時，對枯草桿菌有一定的抑制作用，質(zhì)量濃度為150 mg干花/mL時，對曲霉的抑制作用不太明顯，在試驗濃度范圍內(nèi)木槿花提取液對大腸桿菌、枯草桿菌、曲霉、金黃色葡萄球菌4種菌種未能完全抑制。Punasiya采用水、甲醇、石油醚、苯、氯仿對木槿葉進行了萃取，并研究每種萃取物對蠟狀芽孢桿菌(MTCC-430)、表皮葡萄球菌(MTCC-435)、肺炎克雷伯氏菌(MTCC-432)和枯草芽孢桿菌(MTCC-121)的抗菌性。結(jié)果顯示每種提取物都有一定的抗菌活性，但不同提取物的抗菌活性之間存在差異，甲醇提取物對4種細菌具有最好的抑制活性，其對蠟狀芽孢桿菌(MTCC-430)、表皮葡萄球菌(MTCC-435)、肺炎克雷伯氏菌(MTCC-432)和枯草芽孢桿菌(MTCC-121)的最小抑菌濃度(MIC)分別為312，156，312，78 μg/mL。本研究發(fā)現(xiàn)木槿皮的乙醇提取物也具有較好的抗菌活性，其對大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、糞腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、地衣芽孢桿菌和高地芽孢桿菌的最小抑菌濃度(MIC)分別為306，470，544，246，271，654，276 μg/mL，對比發(fā)現(xiàn)：木槿花提取物對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用較好，木槿葉提取物對枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的抑制作用較好，木槿皮提取物對金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和高地芽孢桿菌的抑菌性較好；木槿皮提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌效果好于木槿花提取物，對肺炎克雷伯氏菌的抑菌效果要好于木槿葉提取物，但對枯草芽孢桿菌的抑菌性要弱于木槿葉提取物。主要原因是植物的化學成分在不同的生長部位存在組成和含量的差異，而其抑菌性是多種成分共同作用的結(jié)果。

4 結(jié)論

木槿具有藥用、食用、觀賞兼?zhèn)涞膬r值，是一種很有開發(fā)前景的綠色經(jīng)濟植物，目前國內(nèi)外對木槿的花和葉進行了大量的研究。本文以無水乙醇為溶劑，對木槿皮進行了超聲波萃取，通過GC×GC-Q-TOFMS對提取物的揮發(fā)性成分進行了分析，共鑒定出41種揮發(fā)性成分，主要成分為己二酸-(2-乙基己基)酯(21.35%)、亞油酸(6.25%)、油酸(5.70%)和14-甲基十六酸異丙酯(3.67%)；提取物對大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、地衣芽孢桿菌、高地芽孢桿菌、糞腸球菌、肺炎克雷伯氏菌均有一定的抑制作用，本研究為木槿皮作為一種天然食品抑菌劑的進一步開發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù)。