響應(yīng)面法優(yōu)化乳雙歧桿菌Z-1 高密度發(fā)酵培養(yǎng)基

徐顯睿 李翠鳳 張宗博 李道河 隋勇軍 陳政言 張?zhí)m威

（1青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司食品實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266000） （2青島諾和諾康實(shí)業(yè)有限公司，山東青島 266000）（3中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266000）

乳雙歧桿菌具有調(diào)節(jié)腸道，促進(jìn)腸道健康，提高免疫力，抑制有害菌生長和預(yù)防胃腸疾病等多種生理功能。為了將乳雙歧桿菌產(chǎn)業(yè)化并用于乳品、保健品和各類功能食品中，通常采用高密度培養(yǎng)方式提高菌體活菌數(shù)，獲得盡可能高的體積生產(chǎn)率。高密度培養(yǎng)是通過較短的發(fā)酵周期和較低的發(fā)酵體積，從而降低益生菌產(chǎn)業(yè)化成本，加快益生菌相關(guān)產(chǎn)品的商業(yè)化發(fā)展進(jìn)程，進(jìn)而提高產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。因此對(duì)于益生菌功能性食品，乳酸菌高密度培養(yǎng)技術(shù)極其關(guān)鍵。

乳雙歧桿菌Z-1 是一株經(jīng)篩選具有潛在益生功能的菌株，具有較強(qiáng)的耐胃酸、耐腸液能力和細(xì)胞黏附性。本試驗(yàn)對(duì)乳雙歧桿菌Z-1 的培養(yǎng)基進(jìn)行系統(tǒng)化分析，優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，以期對(duì)乳雙歧桿菌Z-1 凍干菌粉的產(chǎn)業(yè)化提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

乳雙歧桿菌Z-1（Bifidobacteriumlactis Z-1），由青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司食品實(shí)驗(yàn)室菌種資源庫保藏。葡萄糖、蔗糖、乳糖、大豆蛋白胨、蛋白胨、胰蛋白胨、檸檬酸銨、牛肉膏、酵母膏、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、硫酸錳、氯化鈉、吐溫80、L-半胱氨酸鹽酸鹽，均為分析純，上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胡蘿卜汁，福建綠泉食品有限公司；玉米漿，廣西百果園果汁有限公司；麥芽汁，煙臺(tái)麥特爾生物技術(shù)有限公司；莫匹羅星鋰鹽，青島高科技工業(yè)園海博生物技術(shù)有限公司；瓊脂，北京索萊寶科技有限公司。

改良MRS 液體培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蛋白胨1%、酵母膏0.5%、牛肉膏1%、磷酸氫二鉀0.12%、檸檬酸銨0.26%、硫酸鎂0.058%、硫酸錳0.005%、吐溫80 0.15%、L-半氨酸鹽酸鹽0.1%。

乳雙歧桿菌固體計(jì)數(shù)培養(yǎng)基：乳糖2%、胰蛋白胨0.5%、大豆蛋白胨1.5%、酵母膏0.3%、牛肉膏0.4%、吐溫80 0.1%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.1%、莫匹羅星鋰鹽0.005%、瓊脂1.5%。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

YXQ-LS-50SⅡ型立式高壓蒸汽滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SW-CJ-1F 型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；AG050 型，厭氧培養(yǎng)罐：廣州雷得生物技術(shù)有限公司；SE6001FZH，電子天平美國奧豪斯公司；MEI04E型，分析天平梅特勒托利多公司；PHS-3C 型，pH計(jì)上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LRH-250 型，生化培養(yǎng)箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MX-S 型，旋渦振蕩器美國賽洛捷克公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的活化

將乳雙歧桿菌Z-1 接種到改良MRS 液體培養(yǎng)基中，按1%接種量進(jìn)行活化，經(jīng)2 次傳代，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)12 h 獲得對(duì)數(shù)生長期的菌液。

1.2.2 單因素試驗(yàn)優(yōu)化培養(yǎng)基

將經(jīng)活化2 代的菌體接種到2%不同碳源（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、1%不同氮源（蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨）、3%不同生長因子（胡蘿卜汁、麥芽汁、玉米漿） 的改良MRS 液體培養(yǎng)基中厭氧培養(yǎng)12 h，采用乳雙歧桿菌固體計(jì)數(shù)培養(yǎng)基按GB 4789.34—2016 方法進(jìn)行活菌數(shù)測(cè)定。

1.2.3 Plackett-Burman 篩選設(shè)計(jì)

以1.2.2 優(yōu)化的增菌培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，通過Plackett-Burman 設(shè)計(jì)，從11 種培養(yǎng)基成分中篩選出對(duì)乳雙歧桿菌Z-1 菌數(shù)有顯著性影響的因素。

1.2.4 最陡爬坡試驗(yàn)

為更好地建立響應(yīng)面擬合方程，確定最佳響應(yīng)值區(qū)域，采用最陡爬坡試驗(yàn)近一步確定主要影響乳雙歧桿菌Z-1 菌數(shù)因素的最優(yōu)濃度。該試驗(yàn)以

1.2.3 中結(jié)果確定各顯著因素爬坡方向及步長。

1.2.5 BBD 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化增菌培養(yǎng)基

響應(yīng)面分析采用多元二次回歸方程擬合因素和響應(yīng)值間的關(guān)系。通過對(duì)乳雙歧增菌培養(yǎng)基成分中的顯著性影響因素與菌體濃度之間的擬合，優(yōu)化培養(yǎng)基中的關(guān)鍵成分，獲得優(yōu)化培養(yǎng)基。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Design-Expert8.0 軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源的選擇

單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，分別按2%（乳糖和葡萄糖各1%） 添加不同碳源、按1%（蛋白胨和胰蛋白胨各0.5%） 添加不同氮源、按3%（麥芽濃縮汁和玉米漿各1.5%） 添加不同生長因子的增菌效果不同。其中乳糖作為碳源增菌效果最好，培養(yǎng)12 h 活菌數(shù)為1.9×109CFU/mL；胰蛋白胨為增菌效果最好的氮源，培養(yǎng)12 h 活菌數(shù)為1.53×109CFU/mL；玉米漿為增菌效果最好的生長因子，培養(yǎng)12 h 活菌數(shù)為1.84×109CFU/mL。因此選擇乳糖、胰蛋白胨和玉米漿為增菌培養(yǎng)基的碳源、氮源和生長因子，20 g/mL 乳糖、10 g/mL 胰蛋白胨和30 g/mL 麥芽汁為響應(yīng)面試驗(yàn)的因素低水平取值。

2.2 Plackett-Burman 試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取乳糖、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、磷酸氫二鉀、檸檬酸銨、硫酸鎂、硫酸錳、吐溫80、L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿共11 種組分進(jìn)行N=20 的Plackett-Burman 試驗(yàn)，確定對(duì)乳雙歧桿菌Z-1 菌量具有顯著影響的因素。

采用PB 試驗(yàn)進(jìn)行因素篩選，采取+1 水平是-1水平的2 倍進(jìn)行設(shè)計(jì)。試驗(yàn)設(shè)計(jì)和響應(yīng)值及分析見表1、表2 和表3。

表1 PB 試驗(yàn)設(shè)計(jì)的變量及不同水平的用量

表2 Plackett-Burman 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 PB 試驗(yàn)顯著性分析表

由表3 可以看出，根據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，影響菌量的極顯著因素共有4 個(gè)，其中磷酸氫二鉀貢獻(xiàn)率為36.33，硫酸鎂貢獻(xiàn)率為10.27，L-半胱氨酸鹽酸鹽貢獻(xiàn)為19.70；玉米漿貢獻(xiàn)率為28.32。由此得出擬合回歸模型方程如下：

菌數(shù)Y=72.77-0.87A+1.13B-0.77C-0.27D+6.83E -0.27F+3.63G+0.37H -0.77J+5.03K +6.03L。

由方差分析表可知，模型有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.64，P＜0.05），調(diào)整R2為0.936 9，說明菌數(shù)的變化93.69%是由所選因素引起的。本模型中信噪比值為16.053，說明了模型的充分性和合理性。在所選因素中磷酸氫二鉀、硫酸鎂、L-半胱氨酸鹽酸鹽、玉米漿對(duì)菌數(shù)的影響在0.01 水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且為正向影響。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)PB 試驗(yàn)，磷酸氫二鉀、硫酸鎂、L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿均為正效應(yīng)，故爬坡方向均向上。以磷酸二氫鉀方程系數(shù)為基準(zhǔn)量分別確定各顯著因素濃度，具體見表4、表5。

表4 最陡爬坡試驗(yàn)各因素步長水平表

表5 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由表5 看出，因素水平在原點(diǎn)+4△處菌量達(dá)到最大，之后菌量減少，最大值出現(xiàn)的響應(yīng)區(qū)間在因素水平4 附近，選擇因素水平4 作為中心點(diǎn)。

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

以磷酸氫二鉀、硫酸鎂、L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿為自變因素，采用響應(yīng)面法對(duì)最佳培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。

2.4.1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平及結(jié)果

運(yùn)用Box-Behnken 組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)磷酸氫二鉀（A）、硫酸鎂（B）、L-半胱氨酸鹽酸鹽（C） 和玉米漿（D） 進(jìn)行四因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平和結(jié)果分別見表6 和表7。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

表7 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

利用Design-Expert 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到二次多項(xiàng)回歸方程：Y（菌量）=105.99 +3.43A -1.90B +0.68C +1.84D -3.17AB -2.28AC -3.16AD+0.32BC+3.57BD -0.66CD -2.87A2-6.10B2-7.55C2-8.66D2。菌量響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析結(jié)果見表8。

由表8 方差分析結(jié)果可知，模型F=23.56，P＜0.0001 差異極顯著，且失擬項(xiàng)p＞0.05，故說明該模型顯著。模型的R2=0.9593，說明擬合程度很好，且R2Adj=0.918 6，R2pre=0.782 7，方差相差很小，說明可信度高，可以用此模型來分析預(yù)測(cè)最優(yōu)培養(yǎng)基。

對(duì)單因素來講，磷酸氫二鉀、硫酸鎂和玉米漿對(duì)菌量影響均顯著，L-半胱氨酸鹽酸鹽對(duì)菌量影響不顯著，各因素對(duì)菌量影響程度為A＞B＞D＞C。對(duì)于交互作用來說，磷酸氫二鉀和硫酸鎂、磷酸氫二鉀和L-半胱氨酸鹽酸鹽、磷酸氫二鉀和玉米漿以及硫酸鎂和玉米漿交互作用對(duì)菌量的影響顯著（P＜0.05），硫酸鎂和L-半胱氨酸鹽酸鹽以及L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿交互作用對(duì)菌量的影響不顯著（P＞0.05），對(duì)于模型的二次項(xiàng)來說均顯著。

2.4.3 響應(yīng)面結(jié)果及分析

不同因素兩兩交互作用對(duì)菌量的影響結(jié)果見圖1～圖6。

表8 菌量響應(yīng)面擬合回歸方程的方差分析

圖1 磷酸氫二鉀和硫酸鎂交互作用對(duì)菌量的影響

圖2 磷酸氫二鉀和L-半胱氨酸鹽酸鹽交互作用對(duì)菌量的影響

圖3 磷酸氫二鉀和玉米漿交互作用對(duì)菌量的影響

圖4 硫酸鎂和L-半胱氨酸鹽酸鹽交互作用對(duì)菌量的影響

圖5 硫酸鎂和玉米漿交互作用對(duì)菌量的影響

圖6 L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿交互作用對(duì)菌量的影響

由圖1 可知，磷酸氫二鉀和硫酸鎂交互作用對(duì)菌量影響的等高線圖為橢圓形，說明對(duì)菌量影響顯著。當(dāng)硫酸鎂不變時(shí)，隨著磷酸氫二鉀的增加，菌量呈迅速上升趨勢(shì)；當(dāng)磷酸氫二鉀不變時(shí)，隨著硫酸鎂增加，菌量呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)磷酸氫二鉀為3.3 g/L，硫酸鎂為1.0 g/L 左右時(shí)菌量達(dá)到最大值。

圖2 反映了磷酸氫二鉀和L-半胱氨酸鹽酸鹽交互作用對(duì)菌量的影響，等高線圖為橢圓形，說明對(duì)菌量影響顯著，當(dāng)L-半胱氨酸鹽酸鹽不變，隨著磷酸氫二鉀的增加，菌量先迅速上升后變化平緩；當(dāng)磷酸氫二鉀不變時(shí)，隨著L-半胱氨酸鹽酸鹽增加，菌量呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)磷酸氫二鉀為3.3 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽為2.4 g/L 左右時(shí)菌量取得最大值。

從圖3 可以看出，磷酸氫二鉀和玉米漿間交互作用對(duì)菌量的影響與圖1 相似，菌量在磷酸氫二鉀為3.3 g/L，玉米漿為82.5 g/L 時(shí)取得最大值。

圖4 反映了硫酸鎂和L-半胱氨酸鹽酸鹽交互作用對(duì)菌量的影響，對(duì)菌量影響的等高線圖近似圓形，說明此因素對(duì)結(jié)果影響不顯著。但當(dāng)固定一個(gè)變量，菌量會(huì)隨著另一個(gè)變量的增大先上升后下降，但隨著因素值的改變，菌量變化不是很明顯。當(dāng)硫酸鎂為1.0 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽為2.48 g/L時(shí)菌量最高。

由圖5 可知，硫酸鎂和玉米漿交互作用對(duì)菌量影響的等高線圖為橢圓形，說明影響顯著，隨著因素的增加，菌量上升，在硫酸鎂為1.0 g/L，玉米漿為82.5 g/L 左右達(dá)到最大值，然后菌量出現(xiàn)下降。

圖6 為L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿交互作用對(duì)菌量的影響，等高線圖為圓形，說明對(duì)菌量的影響不顯著，在L-半胱氨酸鹽酸鹽為2.48 g/L，玉米漿為83.0 g/L 取得最大值。

由圖1～圖6 可知，響應(yīng)面圖均為開口向下的凸面，故響應(yīng)值R 存在極大值，為進(jìn)一步優(yōu)化結(jié)果，根據(jù)Design-Expert 軟件得出在磷酸氫二鉀、硫酸鎂、L-半胱氨酸鹽酸鹽和玉米漿交互影響下，菌量最優(yōu)條件為：磷酸氫二鉀3.228 g/L，硫酸鎂0.972 g/L，L-半胱氨酸鹽酸鹽2.451 g/L，玉米漿81.298 g/L，在此條件下模型預(yù)測(cè)的菌量107.329×108CFU/mL。在37 ℃條件下恒溫培養(yǎng)12 h，實(shí)際菌量為104.67×108CFU/mL，因此該模型可較好預(yù)測(cè)乳雙歧桿菌Z-1 的生長情況。

3 結(jié)論

乳雙歧桿菌作為最典型的具有益生功能的菌株，在益生菌產(chǎn)品市場(chǎng)中應(yīng)用極其廣泛。對(duì)乳雙歧桿菌Z-1 發(fā)酵菌數(shù)影響最顯著的因素為磷酸氫二鉀和硫酸鎂。礦物質(zhì)鹽具有促進(jìn)細(xì)胞分裂的作用，Caterine 等指出鎂離子、鉀離子和鈣離子能促進(jìn)乳酸桿菌的增殖，是乳酸菌增殖必需的生長因子。玉米漿富含多種氨基酸、多肽類和維生素，并且含有還原糖及鉀、鎂、鈣、磷等礦物元素。研究表明，維生素可以提高菌體代謝途徑中的磷酸果糖激酶活性，促進(jìn)乳酸菌的生長代謝，還可以降低菌體在培養(yǎng)過程中的死亡率。此外，乳酸菌可直接利用氨基酸，而多肽類則由細(xì)胞內(nèi)的肽酶水解成為游離氨基酸被菌體利用。Etoh 等發(fā)現(xiàn)多肽類可顯著促進(jìn)雙歧桿菌的生長，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。L-半胱氨酸鹽酸鹽是乳雙歧桿菌生長最重要的氨基酸，但試驗(yàn)結(jié)果顯示增菌效果相對(duì)不顯著，可能與培養(yǎng)基中L-半胱氨酸鹽酸鹽的含量有關(guān)。但在交互作用中，磷酸氫二鉀與硫酸鎂、磷酸氫二鉀與L-半胱氨酸鹽酸鹽、磷酸氫二鉀與玉米漿、硫酸鎂和玉米漿增菌效果均得到加強(qiáng)，表明礦物質(zhì)鹽對(duì)于高密度培養(yǎng)基至關(guān)重要，L-半胱氨酸鹽酸鹽與玉米漿交互作用對(duì)菌數(shù)不顯著，可能與培養(yǎng)基中兩者的添加量較多有關(guān)。

通過單因素試驗(yàn)、PB 試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)及響應(yīng)面設(shè)計(jì)得出乳雙歧桿菌Z-1 最優(yōu)培養(yǎng)基組成為：乳糖2%、胰蛋白胨1%、酵母膏0.5%、牛肉膏1%、磷酸氫二鉀0.322 8%、檸檬酸銨0.26%、硫酸鎂0.097 2%、硫酸錳0.005%、吐溫80 0.15%、L-半胱氨酸鹽酸鹽0.245 1%、玉米漿8.129 8%。