UPLC 法同時測定人參香皂中8 種人參皂苷

李彥超，曲正義，王英平，張瑞※

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學人參新品種選育與開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心，吉林 長春 130112；2.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210046；3.中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130122）

人參（Panax ginseng C. A. Mey）是五加科人參屬多年生草本植物，其喜陰耐寒，對土壤的要求極高，我國東北地區(qū)土壤肥沃、氣候適宜，因此，人參在東北山區(qū)被大面積栽培。人參具有悠久的藥用歷史，在我國歷代中醫(yī)藥學著作中，許多都有關(guān)于人參的描述，人參以根部入藥，自古就被稱為補氣的靈藥，具有復(fù)脈固脫、補脾益肺、生津、安神等功效。現(xiàn)代科學研究證明，人參的主要有效成分是人參皂苷[1]。自20 世紀80 年代人參便被應(yīng)用于化妝品中，隨著科技的不斷進步和人們物質(zhì)生活的不斷提高，人們越來越崇尚綠色健康的生活日用品，人參便成為了重要的植物化妝品原料。人參花蕾提取物（人參總皂苷）具有體外清除羥基自由基的能力[2]；張智萍等[3]研究發(fā)現(xiàn)，人參果提取物保濕性優(yōu)于甘油和透明質(zhì)酸，且較后兩者保濕效果持續(xù)時間更長；賈越光等[4]研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷對絡(luò)氨酸酶具有抑制作用，從而達到美白的效果。此外有研究表明，人參具有養(yǎng)發(fā)、育發(fā)防脫、抑制頭屑等功效[5]。人參香皂作為人參類化妝品已逐步被消費者所接受和認可，并占據(jù)著較大的市場，擁有巨大的商業(yè)潛力。

人參皂苷作為人參香皂的標志性成分，可作為評價人參香皂質(zhì)量好壞的指標。然而，我國目前對人參香皂中人參皂苷的添加量仍然沒有統(tǒng)一的標準，鮮見人參香皂中人參單體皂苷檢測方法的研究。因此，本研究采用超高效液相色譜法（UPLC）測定人參香皂中單體皂苷 Rg1、Re、R f、Rb1、Rc、Rb2、Rb3 和 Rd 的含量，為人參香皂中這8 種單體皂苷檢測提供一種穩(wěn)定、方便的方法，也為人參香皂的質(zhì)量控制提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與材料

ACQUITY 超高效液相色譜儀（美國 Waters 公司）；HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司）；電子天平（上海梅特勒－托利多儀器有限公司）。色譜純乙腈（美國費舍爾公司）；超純水（美國Millipore公司）；其他試劑均為分析純（天津津騰實驗設(shè)備有限公司）；D101 大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司）；人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rc、Rb1、Rb2、Rb3、Rd標準品（中國藥品生物制品檢定所）；5 種人參香皂（購于淘寶網(wǎng)店）。

1.2 試驗方法

1.2.1 混合標準品溶液的制備 用電子天平精密稱取8 種人參皂苷標準品，配制成人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 含量分別為 0.33、0.32、0.31、0.30、0.33、0.35、0.30、0.32 mg/mL 的混合標準品溶液。

1.2.2 供試品溶液的制備 用小刀將人參香皂切成直徑不大于1 mm 的細小顆粒，在100 mL 具塞錐形瓶中加入精密稱取的5.00 g 香皂，并加入100 mL 無水乙醇，使用超聲波每次30 min，提取3 次。將所得全部提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮，得到少量提取液，60 ℃水浴蒸發(fā)剩余液體，加入蒸餾水30 mL 使其充分溶解，滴加0.1 mol/L 鹽酸至pH 值約為7。將含有提取物的水溶液加入D101 大孔吸附樹脂，靜態(tài)吸附5 h，濕法裝柱后用500 mL 蒸餾水洗脫并棄去洗脫液，然后用500 mL 質(zhì)量分數(shù)為 80% 的乙醇洗脫并收集，減壓濃縮，得少量濃縮液，60 ℃水浴蒸干，將其溶于無水乙醇并轉(zhuǎn)移到10 mL容量瓶中，再滴加無水乙醇至刻度線，上下反復(fù)振蕩均勻即得。5 種人參香皂供試品溶液均用同樣方法得到。

1.2.3 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱（2.1 mm 50 mm，1.7m）；用乙腈-0.05%磷酸水溶液（A）作為流動相，梯度洗脫：0～3 min，17% → 19% A；3～4min，19%→21%A；4～5min，21%→26%A；5～9min，26% → 27%A；9～12 min，27% → 32%A；12～15 min，32% →43%A。檢測波長為203 nm；柱溫為35 ℃；進樣量為2L；流速為 0.5 mL/min。

1.2.4 標準曲線的繪制 用無水乙醇將混合標準品溶液稀釋成不同濃度，并按順序進樣，在“1.2.3”項下的色譜條件下測定峰面積，以人參皂苷峰面積為縱坐標、人參皂苷濃度為橫坐標繪制標準曲線，見圖1。

圖 1 標準品UPLC 色譜圖Fig1. UPLC chromatogram map of reference substance

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

按“1.2.4”方法繪制標準曲線，得到回歸方程分別如下：

Rg1：Y=922 000X+1 870（r=0.999 9）

Re：Y=1 460 000X+3 640（r=0.999 9）

Rf：Y=838 000X+1 120（r=0.999 9）

Rb1：Y=791 000X+1 820（r=0.999 8）

Rc：Y=658 000X+706（r=0.999 9）

Rb2：Y=952 000X=2 340（r=0.999 9）

Rb3：Y=1 200 000X+2 340（r=0.999 9）

Rd：Y=4 870 000X+1 020（r=0.999 9）。

人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 的線性范圍分別是0.103 130～0.330 000、0.010 000～0.320 000、0.009 688～0.310 000、0.009 375～0.300 000、0.010 313～0.330 000、0.010 938～0.350 000、0.009 375～0.300 000、0.010 000～0.320 000 mg/mL。

2.2 精密度

在“1.2.3”項下的色譜條件下將混合標準品溶液連續(xù)進樣 6 次，得到人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rd、Rc、Rb2、Rb3 的色譜峰 面積，其 RSD 分別是0.87%、0.94%、0.67%、1.32%、1.83%、0.81%、1.69%、0.76%，表明該儀器具有良好的精密度。

2.3 重復(fù)性

將同一份樣品按“1.2.2”項下的方法配制成6 份供試品溶液，在“1.2.3”色譜條件下進樣檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)人參皂苷 Rg1、Re、Rf、Rb1、Rd、Rc、Rb2、Rb3 含量分別為0.722、1.060、0.042、0.358、1.740、0.274、0.311、0.373 mg/g，RSD 分別為0.42%、0.42%、3.61%、2.44%、1.52%、0.73%、1.88%、0.97%，表明該試驗方法具有良好的重復(fù)性。

2.4 穩(wěn)定性

取同一份供試品溶液，1 d 內(nèi)每隔4 h 按“1.2.3”項下的色譜條件進樣測定，得到人參皂苷 Re、Rg1、R f、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 色譜 峰面積的 RSD 分別是0.30%、0.40%、2.63%、2.05%、0.94%、1.33%、0.69%、1.37%，表明該供試品能在24 h 內(nèi)保持穩(wěn)定狀態(tài)。

2.5 加樣回收率

準確稱取一定量的人參皂苷對照品添加到已知含量的人參皂樣品中，按“1.2.2”項下的方法配制得到供試品溶液，在“1.2.3”項下的色譜條件下測定，試驗結(jié)果如表 1 所示。從表 1 可以看出，Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd 的平均回收率分別為93.47%、94.89%、83.53%、86.84%、90.88%、78.59%、83.30%、91.10%，RSD 分別為1.24%、1.56%、1.46%、1.90%、1.81%、2.96%、1.90%、1.74%，表明該方法準確、可靠，可用于人參香皂中8 種人參皂苷的含量測定。

表1 加樣回收率Table 1 Recovery rate （n=8）

2.6 樣品含量測定

每種人參香皂供試品溶液，在“1.2.3”項下的色譜條件下進行測定，試驗結(jié)果如表2 所示。由表2 可知，不同香皂品牌中各人參單體皂苷含量差異較大，其可能原因是在香皂制備過程中多為堿性高溫條件，部分人參單體皂苷在該條件下發(fā)生降解[6]，故檢測含量較少，且不同原料的添加也可能影響人參單體皂苷的含量[7]。

表2 人參香皂中8 種人參皂苷含量Table 2 The content of 8 ginsenosides in ginseng soap（mg/g）

3 結(jié)論與討論

3.1 結(jié)論

本試驗使用無水乙醇對人參皂中人參皂苷進行提取，并通過D101 大孔吸附樹脂使人參皂中的油脂、脂肪酸鈉等雜質(zhì)與人參皂苷能夠較好分離；采用UPLC法對人參香皂中8 種人參皂苷進行分析測定，該法檢測速度更快、靈敏度和分離度更高、工藝穩(wěn)定，為人參香皂的質(zhì)量控制提供理論支撐。

3.2 討論

人參香皂中可能添加人參粉、人參提取物等不同人參原料，且香皂中含有大量的脂肪酸鈉，用水作為提取溶劑效果并不理想，且易產(chǎn)生大量泡沫，造成損失。為降低誤差，故采用無水乙醇作為提取溶劑。

人參皂苷主要采用溶劑萃取法和大孔吸附樹脂吸附純化[8]。因為香皂的主要成分為高級脂肪酸鈉，其性質(zhì)較脂類有區(qū)別，故難以采用乙醚、石油醚等溶劑萃取分離，且易發(fā)生乳化，因此本試驗采用D101 大孔吸附樹脂對人參香皂中的人參皂苷進行純化。香皂溶于少量水中呈膠狀物，通過調(diào)節(jié)pH 至中性可以明顯除去這一現(xiàn)象，有利于人參皂苷吸附在D101 大孔吸附樹脂上。

使用超高效液相色譜法對人參香皂中8 種人參皂苷含量進行分析測定。本方法較HPLC 法檢測時間更短，消耗樣品更少，有利于人參香皂中各人參皂苷的快速檢測，且精確度、重現(xiàn)性、回收率良好[9]。不同品牌的人參香皂產(chǎn)品制作工藝不同，可能添加人參的部位不同，同時添加量也存在差異，產(chǎn)品中人參單體皂苷含量差異較大。在香皂的制備過程中，控制制備條件和加入人參提取物的時間，有利于提高香皂成品中人參單體皂苷含量，對人參系列香皂的制備及質(zhì)量控制具有參考價值。