水貂生長性狀相關基因的分子遺傳標記研究進展

宋姍姍，宋興超，張如，叢波，劉琳玲

（中國農業(yè)科學院特產研究所，農業(yè)農村部特種經濟動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，吉林省特種經濟生物學省部共建國家重點實驗室，吉林 長春 130112）

水貂皮被稱為“裘皮之王”，每年的貿易量約占國際裘皮貿易量的70%[1]，在水貂育種中，與活體毛皮等級及干皮品質相關的性狀均處于強選擇狀態(tài)，公、母水貂體重遺傳力分別為 0.48 和 0.43，公、母水貂皮張長度的遺傳力均為 0.45[2]。因此，對水貂生長性狀（如體重和體長）相關基因進行深入研究顯得尤為重要，并且培育體型大且毛皮品質優(yōu)良的新品種已成為當前水貂育種的目標之一。20 世紀80 年代，遺傳標記即分子遺傳標記技術應運而生，該技術可準確、有效地揭示物種的遺傳變異特性[3-4]，遺傳標記經歷了四個階段，即形態(tài)學標記、細胞學標記、生化標記和DNA 分子標記。伴隨DNA 重組技術的出現(xiàn)，科學家開始研究DNA 多態(tài)性的遺傳標記方法，這使分子遺傳標記技術輔助常規(guī)動物育種成為可能。分子遺傳標記技術的出現(xiàn)在很大程度上提高了育種的有效性，因而分子遺傳標記技術在水貂育種領域備受關注。目前，應用較廣泛的分子遺傳標記主要有限制性片段長度多態(tài)分析技術（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、DNA指紋分析技術（DNA fingerprint）、隨機引物擴增多態(tài)性 DNA 技術（random amplified polymorphism DNA，RAPD）、短段串聯(lián)重復序列（short tandem repeat，STR）和擴增片段長度多態(tài)性分析技術（amplified fragment length polymorphism，AFLP）。本文將概述分子遺傳標記技術在水貂生長性狀相關基因中的應用研究現(xiàn)狀，旨在為今后該技術在水貂育種中的應用提供參考。

1 水貂生長性狀相關基因分子遺傳標記

2007 年，Anistoroaei 等[4]首次獲得水貂簡單重復序列（SSR）標記的遺傳圖譜，并且經過2 次補充完善[5-6]。Thirstrup等[7]利用該遺傳圖譜發(fā)現(xiàn)影響毛皮質量和皮張長度的數(shù)量性狀位點（quantitative trait locus，QTL）；此外，Cirera 等[8]發(fā)現(xiàn) TYRP1 基因內含子 2 中一個長插入片段與美洲水貂帕洛米諾毛色表型存在關聯(lián)；同時采用細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）文庫測序，在水貂基因組中進行同源搜索查找生長相關基因[9]。Thirstrup 等[10]采用限制性酶切位點關聯(lián)DNA 測序技術（restriction-site-associated DNA sequencing，RAD-seq），在水貂中檢測到380個SNPs。大量研究表明高通量測序技術已在水貂育種中廣泛應用，用高通量測序技術構建不同類型的基因組DNA 文庫，并進行序列測定。然后使用生物信息學方法對測序得到的序列進行拼接、組裝和注釋，從而獲得該物種完整的基因組序列信息。Cai 等[11]首次報道水貂全基因組序列信息，這使得鑒定整個水貂基因組中的單核苷酸多態(tài)性（SNP）成為可能。Cai 等[12]采用高通量測序技術獲得2 496 只北美水貂的SNP，經過多輪篩選，保留28 336 個高質量SNP 和2 352 個個體用于全基因組關聯(lián)研究（genome-wide association study，GWAS）。針對水貂體重、行為以及與貂皮質量有關的 10 個性狀進行全基因組關聯(lián)研究（GWAS），發(fā)現(xiàn)WWC3、MAP2K4、SLC7A1 和 USP22 基因可作為水貂體重和毛皮長度的候選基因。2019 年榮敏等[13]利用Illumina HiSeqTM2500 高通量測序平臺構建轉錄組文庫對美國短毛黑水貂快速生長過程中差異顯著性基因進行分析，研究發(fā)現(xiàn)與肌肉生長相關顯著富集GO 條目有66 條，其中44 個相關基因差異表達，這些差異基因可能調控水貂的快速生長，可以為下一步深入研究提供數(shù)據(jù)。

動物的生長軸為GH-GHR-IGF-1-IGF-1R，這些基因均可調控動物機體的生長發(fā)育。生長激素（GH）是一種單鏈蛋白質，幾乎能作用于機體所有類型的組織和細胞，通過影響骨細胞和軟骨細胞的分化和調節(jié)機體的脂肪代謝來調控機體的生長發(fā)育[1]，下面將分別闡述水貂生長性狀相關基因的分子遺傳標記。

1.1 生長激素

生長激素（GH）是一種肽類激素，由垂體中的生長激素細胞合成和分泌，通過雙重作用機制促進成骨、破骨細胞的增殖，從而調控機體的生長發(fā)育[14]。2010 年，李玉梅等[15]采用PCR-SSCP（PCR-single strand conformation polymorphism）方法研究水貂GH 基因多態(tài)性，結果顯示BB 基因型個體與AA 基因型個體皮張長度有顯著相關。關聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)合并基因型與水貂皮長性狀差異顯著。同年，李玉梅等[16]采用同種方法研究發(fā)現(xiàn)C→A 突變產生的3 種基因型與水貂體重具有相關性，BB 基因型個體體重高于AA 基因型個體，2 次研究均采用PCR-SSCP 方法共同證實GH 基因可作為水貂生長性狀相關的候選基因，PCR-SSCP 作為一種分子遺傳標記技術，是一種快速檢測基因的單個核苷酸變異的方法。上述檢測水貂GH 基因的2 個突變位點可作為水貂皮長和體重性狀的遺傳標記位點，為進一步利用分子標記輔助選擇開展水貂新品種選育提供科學依據(jù)。

1.2 胰島素樣生長因子 1

胰島素樣生長因子 1（IGF-1）是細胞生長的重要調控因子[17]，肝臟可分泌體內循環(huán)的IGF-1，前人研究發(fā)現(xiàn)動物的生長發(fā)育與其血液中IGF-1 濃度有關[18]。目前，IGF-1 基因作為影響動物生長的主控基因而成為研究熱點。研究發(fā)現(xiàn)，IGF-1 在胚胎期可以促進胎兒軟骨膜和軟骨細胞的生長發(fā)育[19]，該基因再與GH 協(xié)同作用，重組的IGF-1 能刺激紅細胞的生成。榮敏等[20]對6 個水貂群體進行IGF-1 基因與生長性狀的關聯(lián)分析，首次并未發(fā)現(xiàn)該基因與水貂生長性狀具有相關性，但經過再次試驗發(fā)現(xiàn)2 個SNPs，其中1 個外顯子內存在一處C→G 突變的雜合型AB 型個體體重和皮張長度高于純合 AA 型，具有極顯著差異[21]。隨著研究的深入，霍自雙[22]發(fā)現(xiàn)IGF-1 基因的g.6 194G>A 突變位點對紅眼白水貂的體長有極顯著影響（P ＜ 0.01），g.71 699C ＞ A 突變位點與體長顯著相關（P ＜ 0.05）。單核苷酸多態(tài)性（SNP）分子遺傳標記是繼限制性片段多態(tài)性（RFLP）與微衛(wèi)星標記（SSR）后產生的新一代分子標記，其特點是分布不均勻、豐度高和自動化檢測。當前，該技術已廣泛應用于分子標記輔助選擇育種，上述研究獲得水貂 IGF-1 基因的3 個SNPs 可作為紅眼白水貂體長性狀的遺傳標記，今后應逐步構建并完善水貂SNP 遺傳圖譜，分析篩查到的候選基因突變位點與經濟性狀的相關性，以期進一步豐富水貂分子遺傳學相關研究。

1.3 胰島素樣生長因子 1 受體

胰島素樣生長因子 1 受體（IGF-1R）基因作為生長軸的終端與 IGF-1 結合形成復合體發(fā)揮生物學作用，可使IGF-1R 的酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，從而激活磷酸肌醇 3-激酶（PI3K）和 Ras 蛋白信號通路來阻斷細胞凋亡[23]，調控GH 的分泌、影響機體生長發(fā)育以及促進細胞凋亡、增殖和分化[24-25]。宋姍姍[26]以大體型的銀藍水貂和小體型的美國短毛黑水貂為研究對象，研究IGF-1R 基因與生長性狀相關性，結果顯示c.1 782G ＞ A 與美國短毛黑水貂體重顯著相關（P ＜0.05），且雜合型AA 型個體體重大于其他2 個基因型個體。2019 年進一步研究，以紅眼白水貂、金州黑水貂和咖啡水貂為研究對象，篩查IGF-1R 基因CDS 序列的突變位點，推斷得出 c.207G ＞ A 與金州黑水貂和咖啡水貂體長性狀顯著相關（P ＜ 0.05），其中金州黑水貂野生型GG 基因型為優(yōu)勢基因型；c.1 782G ＞A與咖啡水貂的體長顯著相關（P ＜ 0.05），c.1 782G ＞A 與咖啡水貂的體重差異極顯著，其中突變雜合GA基因型為優(yōu)勢基因型。合并基因型分析發(fā)現(xiàn)：金州黑水貂不同合并基因型與水貂體長、體重均差異顯著，GAGG 基因型個體的體長和體重均顯著高于其他基因型個體[27]。初步推斷GGGA 基因型可能是影響金州黑水貂體長與體重的有利基因型，綜上2 次試驗認為IGF-1R 基因可能是影響水貂生長性狀的候選基因。通過研究 5 個種群水貂 IGF-1R 基因并篩查到 SNP 位點，該位點可作為水貂生長性狀選育的分子遺傳標記，為培育大體型的優(yōu)良水貂品種奠定了理論基礎。

1.4 阿片黑素促皮質激素原

阿片黑素促皮質激素原（pro-opiomelanocortin，POMC）是垂體多種激素的前體，相關肽有黑素皮質素、促腎上腺皮質激素（adrenocor ticotropic hormore，ACTH）和促脂素（lipotrophic hormone，LPH）三大類，可調節(jié)食物的攝入，并且影響機體的能量平衡[28]。研究發(fā)現(xiàn) POMC 基因序列位點的突變可以影響機體的進食量，從而決定機體的體重[29]。劉琳玲等[30]篩查到POMC 基因存在 4 個變異位點，g.171A ＞ G 位點與咖啡貂的體重有顯著相關，AA 型為優(yōu)勢基因型，個體體重最高；g.470T ＞G 位點與咖啡貂的體長具有相關性，TT 基因型為優(yōu)勢基因型；g.470T ＞G 位點與紅眼白水貂的體重顯著相關，TT 型為優(yōu)勢基因型；g.514C ＞T 位點與紅眼白水貂的體長差異顯著（P ＜0.05），CT型個體體長大于CC型和TT型個體。研究發(fā)現(xiàn)POMC基因的變異可影響水貂的體長與體重性狀，還發(fā)現(xiàn)POMC基因具有豐富的遺傳多樣性，得出水貂的POMC 基因g.171A ＞ G 和 g.470T ＞G 這 2 個突變位點可作為咖啡水貂和紅眼白水貂體長和體重性狀的分子遺傳標記位點。

1.5 垂體特異性轉錄因子

垂體特異性轉錄因子（PIT-1）是POU 結構域中的一種蛋白，也是一種DNA 結合蛋白，可調節(jié)機體細胞分化，調控垂體激素分泌細胞基因的轉錄，從而影響動物機體的生長發(fā)育[31]。楊洪雁[32]采用 PCR-RFLP 方法，檢測了水貂PIT-1 基因多態(tài)性并與水貂生長性狀進行關聯(lián)分析，結果表明，C43T 突變位點與水貂體重、胸圍和腹圍性狀差異極顯著（P ＜0.01），A143G 變異位點與水貂體長、體重、體高、胸圍和腹圍性狀差異極顯著（P ＜0.01），DD 基因型為優(yōu)勢基因型。進一步發(fā)現(xiàn)合并基因型 AADD 基因型個體的體重、胸圍、屠宰體重顯著大于BBCC 基因型個體，BBDD 基因型個體體長顯著大于其他基因型個體（P ＜ 0.05）。因此水貂PIT-1 基因的C43T 和A143G 突變位點的合并基因型分析發(fā)現(xiàn)AADD 基因型個體和BBDD 基因型個體為優(yōu)勢基因型，可作為水貂體重、胸圍、屠宰體重和體長性狀的遺傳標記。上述研究采用限制性片段長度多態(tài)分析技術（RFLP），該技術是第一代 DNA 標記。RFLP作為遺傳標記具有其獨特性：①共顯性的標識；②結果不受環(huán)境因素影響；③非等位基因之間無基因互作效應。RFLP 分析技術在水貂育種中的應用將會加快該物種優(yōu)良經濟性狀的選育進展。

2 小結與展望

分子遺傳標記技術在水貂生長性狀相關基因研究中發(fā)揮了重要的作用，大力推動了水貂育種的進程。相關基因包括生長軸相關基因GH-GHR-IGF-1-IGF-1R，在這些基因中應用的遺傳標記技術主要有 AFLP、RFLP 和SNP 技術，其中單核苷酸多態(tài)性（SNP）具有明顯優(yōu)勢，因為它們豐富，遺傳穩(wěn)定且適合高通量自動化分析。然而，由于缺乏水貂有關參考基因組側翼標記序列的信息，這些標記的可用性仍然受到阻礙且成本較高。伴隨組學技術的不斷發(fā)展與創(chuàng)新，新一代分子遺傳標記技術即簡化基因組測序（genotyping-by-sequencing，GBS）應運而生，該技術主要利用二代測序（NGS）的優(yōu)勢來實現(xiàn)低成本和高通量基因分型，通過使用限制性內切酶（restriction endonuclease，RE）降低基因組的復雜性，然后生成NGS 序列標簽[33]。通過選擇對甲基化敏感的RE，可以避免基因組的重復區(qū)域，從而降低基因組的復雜性[34]。下一步應廣泛應用GBS技術在動物中發(fā)現(xiàn)遺傳標記，從而進行種群遺傳學和基因組學研究，全面開發(fā)和研制功能性分子標記和特異基因芯片，使基礎研究成果應用于實際育種生產中成為可能，為真正進入分子設計育種時代奠定基礎。分子標記雖然為水貂育種開辟了一扇大門，但能否在育種實踐中發(fā)揮應有的作用，還需要滿足以下4 個方面：①是否能找到與目的基因性狀緊密連鎖的分子標記；②是否能繪制遺傳標記多態(tài)性豐富的遺傳圖譜；③能否實現(xiàn)自動化分析分子標記，簡化試驗，大大降低成本；④是否能改進預測育種值的方法。當前，這4 個方面已經有所改進和完善，隨著生物技術的飛速發(fā)展，分子標記將在水貂育種中占有重要地位。