犬Ⅰ型腺病毒E1A 蛋白的生物信息學(xué)分析

徐文悅，廉士珍，劉曉穎，鄧效禹，胡博，張蕾，薛向紅，賈琳琳，閆喜軍，朱言柱※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112；2.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，吉林 長春 130118；3.華威特科技有限責(zé)任公司，江蘇 泰州 100085）

腺病毒科中的犬腺病毒（canine adenovirus，CAdV）是一種具有高致病力、可大范圍感染的病毒[1-2]。犬腺病毒基因組為線狀雙股DNA[1]，無囊膜結(jié)構(gòu)，呈二十面體對稱，為30～32 kb，其末端為反向重復(fù)序列[3]。CAdV可分為犬Ⅰ型（CAdV-Ⅰ）和犬Ⅱ型（CAdV-Ⅱ）[4]，2 種犬腺病毒（CAdV）間存在抗原親緣關(guān)系和交叉保護(hù)免疫。

此病無明顯季節(jié)性，CAdV-Ⅰ可感染狐貍和犬，分別引起腦炎和肝炎，腎、肝和呼吸道也經(jīng)常出現(xiàn)病變。此病毒容易在睪丸和犬腎細(xì)胞內(nèi)增殖，也可在豬、水貂和豚鼠肺和腎細(xì)胞中增殖，并出現(xiàn)典型的細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE），主要特征為細(xì)胞變圓腫脹、匯集成葡萄串狀，也可產(chǎn)生蝕斑[5]。CAdV-Ⅰ除了可以感染狐與犬外，還可感染狼、虎和臭鼬等。血清學(xué)研究表明，兔、馬和松鼠等動物也是犬腺病毒的易感動物。在人群中其抗體陽性率較高，而且可檢出補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)抗原，可見人也能隱性感染。CAdV-1 的易感性和致病性在不同動物上存在差異[6]。

1925 年狐貍腦炎被Green 發(fā)現(xiàn)；1947 年犬的傳染性肝炎被Rubarth 發(fā)現(xiàn)；1954 年 Cabasso 等首次分離到 CAdV-Ⅰ；Kapsenberg 在1959 年獲取到該病毒，并證實(shí)ICHV 和狐貍腦炎病毒是同一種腺病毒；1983 年我國發(fā)現(xiàn)此?。?989 年鐘宏志等[2-7]在被感染的狐貍體內(nèi)提取出CAdV-Ⅰ。肝炎型病犬體溫呈現(xiàn)雙相熱型，常有蛋白尿，會出現(xiàn)凝血不良，恢復(fù)期會出現(xiàn)肝炎性藍(lán)眼。狐腦炎是一種罕見的疾病，呈現(xiàn)急劇腦炎癥狀，死亡率達(dá)100%。由于此病毒抵抗力強(qiáng)，致病性和病死率高，并每年可重復(fù)發(fā)生，不僅會危害犬和毛皮動物養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益，而且會危害野生食肉類哺乳動物的安全。

動物感染24 h 后，血、脾、尿和腎開始出現(xiàn)病毒，隨后是肝臟，但在急性期后病毒將會從肝臟中消失，患病動物的腎及尿液中攜帶病毒的時(shí)間可長達(dá)半年以上[8]；慢性死亡的動物，以腎臟作為分離病料，可能較容易獲得成功，但分離的病料來自急性死亡動物時(shí)應(yīng)使用肝臟，原因是肝臟細(xì)胞質(zhì)脆，易于研磨，病毒可以充分被釋放出來[8]。病毒接種到犬腎細(xì)胞（如MDCK）上，細(xì)胞病變最先出現(xiàn)是在接毒后30 h 左右，有時(shí)需要6～7 d，再通過中和試驗(yàn)可鑒別出病毒的類型。血清學(xué)檢查一般采用發(fā)病初期和發(fā)病后14 d 的雙份血清進(jìn)行人O 型紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)。

生物信息學(xué)是檢索、存儲和分析生命科學(xué)研究中獲得大量數(shù)據(jù)的科學(xué)。王晨[9]利用此方法來預(yù)測綿羊ER基因的結(jié)構(gòu)，探討其參與許多腫瘤和生殖有關(guān)的信號通路；王元紅[10]利用此方法來預(yù)測貓傳染性腹膜炎病毒AH 1905 株N 基因，發(fā)現(xiàn)其具有優(yōu)良的特異性和抗原性；劉一鳴等[11]采用此方法分析參與肝臟再生（LR）終止階段調(diào)控的相關(guān)基因，結(jié)果表明；LR基因的主要特點(diǎn)是根據(jù)身體的需要，在終止階段能阻止增殖和生產(chǎn)功能性肝細(xì)胞，其不同之處在于肝腫瘤的擴(kuò)散。該試驗(yàn)利用生物信息學(xué)分析方法來預(yù)測E1A 蛋白的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)。

E1A 基因是一種具有增強(qiáng)子和自身啟動子的早期轉(zhuǎn)錄基因，所編碼的早期蛋白正向調(diào)節(jié)腺病毒其他基因的活化，并對宿主細(xì)胞有調(diào)節(jié)作用[12]。E1A 參與哺乳動物細(xì)胞的致瘤轉(zhuǎn)化，是病毒和某些細(xì)胞基因表達(dá)的激活物。目前尚不清楚ElA 是直接與DNA 聚合酶、RNA聚合酶、其他轉(zhuǎn)錄因子發(fā)生相互作用來誘導(dǎo)基因表達(dá)，還是通過影響其他細(xì)胞因子（如細(xì)胞阻遏物失活）來間接起作用。此外，E1A 在細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用是其基因激活潛能的結(jié)果，還是另一種不相關(guān)的E1A功能，目前也尚不確定。E1A蛋白是潛伏感染中腺病毒持續(xù)表達(dá)最重要的效應(yīng)蛋白[13]。為進(jìn)一步了解E1A，本研究通過在線數(shù)據(jù)庫和分析軟件來預(yù)測E1A 蛋白的理化性質(zhì)和生物結(jié)構(gòu)，以期為進(jìn)一步研究E1A提供依據(jù)，為未來建立CAdV-Ⅰ的抗體檢測方法和亞單位疫苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

E1A 的DNA 序列，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所朱言柱老師提供。

1.2 E1A 蛋白的一般理化性質(zhì)的預(yù)測

通過SnapGene 軟件（GraphPad Software 公司），獲得E1A 蛋白的氨基酸序列；使用Protparam（http://web.expasy.org/protparam/，SIB 瑞士生物信息學(xué)研究所）對E1A 蛋白進(jìn)行分析，預(yù)測并獲得E1A 蛋白的一般理化性質(zhì)，主要內(nèi)容包括相對分子質(zhì)量、不穩(wěn)定指數(shù)、等電點(diǎn)、分子式、帶正負(fù)電荷的氨基酸殘基數(shù)及序列組成。

1.3 E1A 蛋白的親疏水性、信號肽及跨膜區(qū)預(yù)測

使用 ProtScale 軟件（https：//web.expasy.org/protscale/，SIB 瑞士生物信息學(xué)研究所）對E1A 的親疏水性進(jìn)行預(yù)測；使用SignalP 5.0 Server 在線軟件(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/，DTU Bioinformatics）測定E1A 的信號肽；使用在線軟件TMHMM Server 2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/，DTU Bioinformatics）分析 E1A 的跨膜區(qū)。

1.4 E1A 蛋白的糖基化位點(diǎn)及磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測

使用 NetNGlyc 1.0 Server(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/，DTU Bioinformatics），預(yù)測 E1A蛋白的糖基化位點(diǎn)；使用NetPhos 3.1 Server (http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/，DTU Bioinformatics），預(yù)測 E1A 的磷酸化位點(diǎn)。

1.5 E1A 蛋白二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

使用 SOPMA (https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_sopma.pl，PRABI 公司）對 E1A 蛋白的 -折疊、-螺旋、無規(guī)則卷曲等進(jìn)行預(yù)測。

1.6 E1A 蛋白三級結(jié)構(gòu)的預(yù)測

使用 Phyre2 (http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index，倫敦帝國學(xué)院結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)小組）對E1A 蛋白生成蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型，利用預(yù)測結(jié)果進(jìn)行蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)分析，主要分析蛋白與模型的可信度和蛋白覆蓋率。

1.7 E1A 蛋白抗原決定簇的預(yù)測

使用Predicting Anti-genic Peptides(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl，馬德里康普盧滕斯大學(xué)）預(yù)測E1A 蛋白的抗原決定簇。

2 結(jié)果與分析

2.1 E1A 蛋白的一般理化性質(zhì)

E1A 蛋白的氨基酸序列為

*S*LLSRHRAVFMNMFLSYWKIGSRNVSPVSTPMVARHHRVFMIFLILSWKILVLLLRCCVIGVRRLTVNLQFPRRLMLALL*TLRRFLLFLRIPLLLQVFLRTCCCV*RRCLPLMTGMRFGVRPPPLSTGKITLTLMLGLFLVVCVVPITRSRGRIPFVGFVT*RPLLKALRHACSRRTC*C*CRRG**GHFCVC*TWFQKEVSGDFPRLS*KQ*TPLLARA*TN*TFGSFPKATPAI。

E1A 蛋白的相對分子質(zhì)量為25 789.61，等電點(diǎn)為11.86，分子式為C1176H1926N340O268S21，氨基酸數(shù)量為225 個(gè)，正、負(fù)電荷氨基酸殘基的數(shù)量分別為36和2，不穩(wěn)定指數(shù)為50.39，氨基酸組成，見表1。

2.2 E1A 蛋白的親疏水性、信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)

E1A 蛋白是平均親水系數(shù)0.524 的疏水性蛋白，見圖1；E1A 蛋白的信號肽可能性為0.005 3，見圖2；E1A 蛋白形成了跨膜結(jié)構(gòu)，見圖3。

表1 氨基酸組成Table 1 Amino acid composition

圖1 E1A 的親疏水性預(yù)測結(jié)果Fig.1 Hydrophilic and hydrophobic prediction results of E1A protein

圖2 E1A 蛋白的信號肽預(yù)測結(jié)果Fig. 2 Signal peptide prediction results of E1A protein

圖3 E1A 蛋白的跨膜區(qū)預(yù)測結(jié)果Fig. 3 Transmembrane region prediction results of E1A protein

2.3 E1A 的糖基化位點(diǎn)和磷酸化位點(diǎn)

E1A 蛋白無糖基化位點(diǎn)，見圖4；E1A 蛋白存在9個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)（4、16、22、26、125、149、195、202和217），存在10個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)（30、66、81、126、130、132、188、205、214 和 222），不存在酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，見圖5。

圖4 E1A 蛋白的糖基化位點(diǎn)的結(jié)果Fig. 4 Prediction results of glycosylation site of E1A protein

圖5 E1A 蛋白的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測結(jié)果Fig. 5 Prediction results of phosphorylation site of E1A protein

圖6 E1A 蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.6 The secondary structure prediction results of E1A protein

2.4 E1A蛋白的二級結(jié)構(gòu)

從圖6 可以看出，13 個(gè)氨基酸（5.78%）參與E1A-折疊的形成；84 個(gè)氨基酸（37.33%）參與E1A -螺旋的形成；46 個(gè)氨基酸（20.44%）參與E1A 蛋白延伸鏈的形成；82 個(gè)氨基酸（36.44%）參與E1A 蛋白無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)的形成。由此可見，-螺旋和無規(guī)則卷曲是E1A 蛋白二級結(jié)構(gòu)中最主要的蛋白質(zhì)元件。

2.5 E1A蛋白的三級結(jié)構(gòu)

建立E1A蛋白三級結(jié)構(gòu)的三維空間模型，見圖7。從圖7 可以看出，21 個(gè)殘基（占9%）通過單個(gè)最高得分模板以19.0%的置信度建模。

圖7 E1A 蛋白的三級結(jié)構(gòu)空間模型預(yù)測結(jié)果Fig. 7 The spatial model prediction results of tertiary structure of E1A protein

2.6 E1A蛋白的抗原決定簇結(jié)果

預(yù)測結(jié)果（表2）顯示，該蛋白有6 個(gè)抗原決定簇，分別為 24～69、73～110、118～127、129～146、152～192 和194～209 位，平均抗原傾向是1.0785。

表2 抗原決定簇的預(yù)測結(jié)果Table 2 Prediction results of antigen determination cluster

3 結(jié)論與討論

通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，E1A 是編碼225 個(gè)氨基酸的疏水性蛋白。E1A 蛋白無信號肽，無信號肽結(jié)構(gòu)的蛋白更容易形成包涵體。E1A 無糖基化位點(diǎn)。在E1A蛋白的磷酸化過程中，絲氨酸和蘇氨酸的主要功能是為激活蛋白質(zhì)的活力而變構(gòu)蛋白質(zhì)，即激活酶活力；結(jié)合蛋白，促進(jìn)形成多蛋白復(fù)合物是酪氨酸的主要功能。蘇氨酸和絲氨酸磷酸化位點(diǎn)在E1A 中占比較高，但無酪氨酸的磷酸化位點(diǎn)。在 E1A 的二級結(jié)構(gòu)中，占比由高到低依次為 -螺旋結(jié)構(gòu)、無規(guī)則卷曲、延伸鏈、-折疊。-折疊和無規(guī)則卷曲區(qū)域的二級結(jié)構(gòu)松散，其穩(wěn)定性較差，所以更容易扭曲和盤旋，與抗體分子結(jié)合。該研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E1A 蛋白具有潛在的抗原決定簇，可作為診斷技術(shù)的候選蛋白靶點(diǎn)，將疫苗免疫與天然致敏動物區(qū)分開來，為犬Ⅰ腺病毒疾病的防控提供了新思路。

E1A 在等電點(diǎn)時(shí)，其分子的凈電荷數(shù)為零，以兩性離子的方式存在。由于不同顆粒的電荷的E1A 相互吸引作用，E1A 顆粒發(fā)生沉淀，有利于懸浮液的過濾。劉讓東等[14]通過新研制的M-IPG 柱對蛋白質(zhì)藥物的等電點(diǎn)值進(jìn)行測試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在單克隆抗體藥物和融合蛋白質(zhì)藥物的聚焦分離及等電點(diǎn)測定中新制 M-IPG柱和老式的HPC 涂層柱顯示出相同的結(jié)果；利用蛋白質(zhì)的一般理化性質(zhì)，對于用來分離、鑒別不同的蛋白有很大的幫助；姜燕蓉等[15]利用等電點(diǎn)沉淀法提取牡蠣蛋白，測得其中鹽溶性蛋白含量最高。E1A 蛋白的等電點(diǎn)為11.86，利用預(yù)測出的等電點(diǎn)數(shù)據(jù)，有助于測定氨基酸的含量和分離目的蛋白。

預(yù)測有無信號肽，對于判斷E1A蛋白是否為分泌蛋白有較大的意義。魏薔等[16]利用信號肽試驗(yàn)實(shí)現(xiàn)E2蛋白的分泌表達(dá)和 gp67 介導(dǎo)的 E2 蛋白在昆蟲細(xì)胞桿狀病毒的表達(dá)系統(tǒng)中的高效分泌表達(dá)，并純化得到較高純度的E2 蛋白，有利于其亞單位疫苗的研發(fā)；孫振文等[17]通過構(gòu)建不同信號肽的O 型口蹄疫病毒重組表位蛋白的真核表達(dá)載體試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，合適的分泌型信號肽可以促進(jìn) O 型口蹄疫病毒重組表位蛋白在CHO中的分泌；陳英等[18]研究不同信號肽對GLP-1-Fc 融合蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，信號肽的優(yōu)良選擇對于蛋白的分泌和關(guān)鍵質(zhì)量屬性都具有重要意義。E1A 蛋白無信號肽意味著其不是分泌蛋白，容易形成包涵體，有利于藥物靶點(diǎn)篩選和疫苗研發(fā)。

糖基化是一種主要的蛋白質(zhì)翻譯后進(jìn)行修飾的調(diào)控機(jī)制。對復(fù)雜生物樣品中糖蛋白的全局和位點(diǎn)特異性分析可以促進(jìn)對糖蛋白功能和細(xì)胞活動的理解。通過蛋白質(zhì)糖基化修飾可以調(diào)節(jié)蛋白的生物活性、空間構(gòu)象和細(xì)胞通信等，因此對E1A 蛋白的糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析具有十分重要的意義。潘昱婷等[19]利用蛋白糖基化相關(guān)試驗(yàn)數(shù)據(jù)，推斷出E 蛋白N 連接糖鏈（又稱N的糖基化）不僅能維持抗原構(gòu)象，而且與病毒的感染力及毒力有關(guān)。因此，通過N 的糖基化修飾可以開發(fā)出新型的黃病毒疫苗；Lombana等[20]利用n-連接聚糖的糖基化位點(diǎn)特異性插入到抗原表面來掩蓋局部區(qū)域，發(fā)現(xiàn)通過與先前報(bào)道的切割位點(diǎn)相鄰的GEM 表位結(jié)合的抗體可以有效抑制MICA 的脫落，而這些抗MICA/B 抗體可以在體內(nèi)阻止腫瘤的生長；Arya 等[21]利用高分辨率質(zhì)譜分析肽質(zhì)量指紋圖譜，系統(tǒng)分析了AAV8 衣殼糖基化譜，以確定衣殼糖基化的存在，得出AAV8 辣椒蛋白上確實(shí)有天然N-糖基化的存在。E1A蛋白沒有糖基化位點(diǎn)，說明其沒有與糖鏈連接的位點(diǎn)，可能與判斷其是否為糖蛋白有一定的相關(guān)性。

由于在底物蛋白的氨基酸側(cè)鏈上添加了附有強(qiáng)負(fù)電荷的磷酸基團(tuán)，從而對蛋白的穩(wěn)定性、構(gòu)象以及與其他蛋白分子之間的相互作用有較大影響。大量研究表明，蛋白磷酸化在許多生理、生化過程中發(fā)揮著重要作用，包括細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和代謝途徑等。洪濤等[22]通過分析縫隙連接蛋白Cx43 磷酸化位點(diǎn)在腦血管痙攣中的影響，發(fā)現(xiàn)其可能與腦血管痙攣密切相關(guān)，可能是CBX 緩解腦血管痙攣的機(jī)制之一；Chandra 等[23]通過絨毛蛋白的位點(diǎn)特異性磷酸化試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Tyr499 是絨毛蛋白的關(guān)鍵磷酸化位點(diǎn)，并負(fù)責(zé)促進(jìn)病毒巢細(xì)胞的融合。易和友等[24]研究了豬繁殖與呼吸綜合征病毒的N 蛋白的磷酸化修飾，結(jié)果顯示N 蛋白磷酸化位點(diǎn)突變影響PRRSV 的復(fù)制及亞基因組轉(zhuǎn)錄。E1A 蛋白具有10 個(gè)蘇氨酸位點(diǎn)、9 個(gè)絲氨酸位點(diǎn)，無酪氨酸位點(diǎn)，可能說明無法給結(jié)合蛋白提供一個(gè)結(jié)構(gòu)基因，無法促進(jìn)形成多蛋白復(fù)合體，即不能構(gòu)成細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的基本機(jī)制。E1A 蛋白通過磷酸化修飾有利于CAdV 疾病的分子標(biāo)志或治療靶標(biāo)研究。

預(yù)測E1A蛋白的二級結(jié)構(gòu)與三級結(jié)構(gòu)，有助于了解E1A的生物功能。齊寶坤[25]通過對大豆分離蛋白二級結(jié)構(gòu)的相關(guān)試驗(yàn)，得出當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子中 -螺旋含量低、-折疊及無規(guī)卷曲含量高時(shí)，蛋白質(zhì)分子會變得更加無規(guī)律性；吳喆瑜[26]通過黑曲霉 -L-鼠李糖苷酶Rha1 的二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測試驗(yàn)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Rha1 的晶體結(jié)構(gòu)與已知的4 個(gè) -L-鼠李糖苷酶相似，都具有一個(gè)（ / ）6 桶狀結(jié)構(gòu)域。E1A 蛋白的二級、三級結(jié)構(gòu)有利于對犬腺病毒疾病的防治研究。

為探討E1A蛋白是否具有抗原性，該研究預(yù)測了其抗原決定簇。吳文星[27]發(fā)現(xiàn) 3B 蛋白含有3 個(gè)抗原決定簇。E1A 蛋白有6 個(gè)抗原決定簇，但其是表面抗原決定簇還是內(nèi)部抗原決定簇還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。CAdV-Ⅰ引起的2 種疾病是世界范圍內(nèi)最重要的動物腺病毒感染，所以運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法研究CAdV-Ⅰ的E1A 蛋白可使人們更加了解CAdV-Ⅰ。

以上研究結(jié)果有利于進(jìn)一步開展E1A蛋白研究，為建立 CAdV-Ⅰ的抗體檢測方法和亞單位疫苗提供基礎(chǔ)。

本研究運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法預(yù)測E1A蛋白，但生物信息學(xué)是在已有知識基礎(chǔ)上的預(yù)測，所以還需要未來對此進(jìn)行進(jìn)一步研究探討。