霉菌毒素引起狐貍流產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)室診斷及防控措施

喬連江，張萍，金春彬，楊艷玲※

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112；2.通化農(nóng)業(yè)學(xué)校，吉林 通化 134000）

狐貍流產(chǎn)是人工飼養(yǎng)條件下一種常見(jiàn)的生殖系統(tǒng)疾病，引起流產(chǎn)的原因很多，包括細(xì)菌、病毒和寄生蟲(chóng)等病原微生物引起的傳染性因素以及應(yīng)激、營(yíng)養(yǎng)不良和機(jī)械損傷等引起的非傳染性因素[1-3]。霉菌毒素作為一類(lèi)真菌代謝的有毒物質(zhì)，主要存在于谷物、堅(jiān)果、棉籽及一些與動(dòng)物飼料相關(guān)的產(chǎn)品中[4-5]。當(dāng)狐貍采食被霉菌毒素污染的飼料時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)中毒癥狀，輕則引起食欲減退、繁殖障礙、免疫力下降，繼發(fā)多種疾病等，重則引起狐貍的直接死亡。

霉菌毒素是谷物或飼料中霉菌生長(zhǎng)產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物，其造成的危害是一個(gè)全球性的問(wèn)題[6]。目前，已知的霉菌毒素有300 多種，常見(jiàn)的有黃曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、T-2 毒素、赭曲毒素和伏馬毒素等。其中，黃曲霉毒素在臨床上多表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢、肝臟損傷、流產(chǎn)及免疫抑制等；玉米赤霉烯酮是一種具有雌性激素類(lèi)物質(zhì)活性的毒素，可造成母畜假懷孕、不發(fā)情和持續(xù)性不孕等；T-2 毒素作為毒性高的免疫抑制物質(zhì)，可破壞淋巴系統(tǒng)，危害生殖系統(tǒng)等；赭曲毒素主要由曲霉菌產(chǎn)生，臨床上多表現(xiàn)為高毒性，可致癌；伏馬毒素可對(duì)某些家畜產(chǎn)生急性毒性及潛在的致癌性[7-11]。

近年來(lái)，霉菌毒素引起的狐貍流產(chǎn)病例時(shí)有發(fā)生，尤其在最近幾年呈上升趨勢(shì)，嚴(yán)重影響我國(guó)毛皮動(dòng)物的健康養(yǎng)殖，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，已發(fā)現(xiàn)牛、豬、羊和兔等動(dòng)物均可因食入霉菌毒素污染的飼料而引起繁殖障礙疾病，且該病尚未發(fā)現(xiàn)特效藥[12-13]，給動(dòng)物規(guī)?；B(yǎng)殖帶來(lái)了巨大損失。為了引起養(yǎng)殖戶對(duì)黃曲霉毒素的重視，并了解其危害，本研究對(duì)吉林省某狐貍養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生的不明原因流產(chǎn)病例，進(jìn)行了臨床剖檢、病變組織和器官診查并開(kāi)展了實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，以期確定引起狐貍流產(chǎn)的病因，為近年來(lái)發(fā)病率逐漸增加的狐貍流產(chǎn)防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來(lái)源

吉林省某規(guī)?；傪B(yǎng)殖場(chǎng)中240 只妊娠母狐，配種后45～60 日齡開(kāi)始流產(chǎn)、產(chǎn)死胎和弱胎。目前，已經(jīng)流產(chǎn)或產(chǎn)死胎及弱胎共150 窩。

1.2 病料采集

現(xiàn)場(chǎng)觀察發(fā)病狐貍的情況，并調(diào)查病狐采食飼料的組成和來(lái)源。無(wú)菌采集流產(chǎn)狐貍的血液、肝臟、脾臟、腎臟、子宮體、腸系膜淋巴結(jié)及流產(chǎn)胎兒等組織，并對(duì)其進(jìn)行標(biāo)號(hào)，冷藏保存。

1.3 主要試劑

布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)抗原（中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所）；黃曲霉毒素總量ELISA檢測(cè)試劑盒、玉米赤霉烯酮ELISA 檢測(cè)試劑盒、T-2 毒素ELISA 檢測(cè)試劑盒、嘔吐毒素ELISA檢測(cè)試劑盒和伏馬毒素ELISA檢測(cè)試劑盒（江蘇省蘇微微生物研究有限公司）；TSA 固體培養(yǎng)基（Sigma 公司）；DNA/RNA 提取試劑盒（TakaRa 公司）。

1.4 主要儀器

酶標(biāo)儀（BioTek公司）；恒溫恒濕培養(yǎng)箱（MEMMERT 公司）；PCR 擴(kuò)增儀（美國(guó) Bio-Rad 公司）。

1.5 病理剖檢

對(duì)流產(chǎn)狐貍進(jìn)行解剖，診查各個(gè)臟器的變化，判定病理變化的部位、程度及其性質(zhì)，并采集病變臟器作為實(shí)驗(yàn)室診斷的樣本。

1.6 布魯氏菌病檢測(cè)

為了確定引起狐貍流產(chǎn)的病因是否是由于布魯氏菌感染而引起的，利用布魯氏菌虎紅平板凝集試驗(yàn)對(duì)采集的流產(chǎn)母狐血清樣品進(jìn)行了檢測(cè)，具體操作流程參照虎紅平板凝集試驗(yàn)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。布魯氏菌病陰、陽(yáng)性的判定標(biāo)準(zhǔn)為是否出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的凝集。

1.7 細(xì)菌培養(yǎng)

為了進(jìn)一步明確引起此次流產(chǎn)的病原是否是加德納氏菌等病原微生物，在無(wú)菌條件下，對(duì)流產(chǎn)狐貍子宮及流產(chǎn)胎兒肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離、培養(yǎng)試驗(yàn)。嚴(yán)格按照無(wú)菌操作原則處理取回的臟器，分別取少許將其均勻涂布于TSA培養(yǎng)基上，倒置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。

1.8 病毒檢測(cè)

1.8.1 病料處理 由于狐貍肝臟黃染、變性壞死，因此進(jìn)一步對(duì)流產(chǎn)狐貍進(jìn)行犬腺病毒檢測(cè)。將采集的狐貍臟器經(jīng)液氮研磨后，與無(wú)菌ddH2O 充分混勻，取1.2 mL 置于 1.5 mL EP 管中，6 000 r/min、4 ℃下離心 5 min，取上清經(jīng)0.22m 濾膜過(guò)濾后備用。采集血液樣品，取 1.2 mL 置于 1.5 mL EP 管中，6 000 r/min 下離心5 min，取上清經(jīng)0.22m 濾膜過(guò)濾后備用。

1.8.2 DNA 提取 取“1.8.1”中的濾液200L，利用TaKaRa 公司生產(chǎn)的DNA/RNA 提取試劑盒進(jìn)行核酸提取，﹣20 ℃下保存。

1.8.3 PCR 檢測(cè) 根據(jù)參考文獻(xiàn)[14]中檢測(cè)犬腺病毒（canine adenovirus，CAV）的方法，對(duì)采集樣品進(jìn)行PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，觀察電泳結(jié)果。

1.9 真菌毒素ELISA檢測(cè)

為了確定狐貍流產(chǎn)是否由霉菌毒素中毒引起，分別對(duì)臨床上采集的流產(chǎn)狐貍病料進(jìn)行了黃曲霉毒素總量、伏馬毒素、T-2 毒素、赭曲霉素和玉米赤霉烯酮5 種霉菌毒素的檢測(cè)。檢測(cè)方法參照江蘇省蘇微微生物研究有限公司真菌毒素 ELISA 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

2 結(jié)果與分析

2.1 剖檢變化

通過(guò)對(duì)流產(chǎn)狐貍進(jìn)行剖檢，剖檢結(jié)果顯示狐貍肝臟出現(xiàn)黃染、壞死、質(zhì)脆和腫脹（圖1 A），膽汁淤積（圖1 B），腸系膜淋巴結(jié)腫脹、壞死（圖1 C），胃穿孔（圖1 D），肺臟蒼白（圖 1 E），產(chǎn)死胎或弱胎（圖 1 F）。

圖1 流產(chǎn)狐貍臨床解剖及各臟器病理變化Fig.1 The clinical anatomy of aborted fox and the pathological changes of various organs

2.2 布魯氏菌病虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)流產(chǎn)狐貍的血清進(jìn)行虎紅平板凝集試驗(yàn)（圖2），結(jié)果顯示流產(chǎn)狐貍血清未與布魯氏菌診斷抗原發(fā)生凝集現(xiàn)象。因此，可以排除此次狐貍流產(chǎn)是由布魯氏菌病感染而引起的。

圖2 虎紅平板凝集試驗(yàn)結(jié)果Fig.2 The results of RBPT

2.3 細(xì)菌培養(yǎng)

對(duì)流產(chǎn)狐貍、流產(chǎn)胎兒肝臟及子宮內(nèi)容物進(jìn)行細(xì)菌分離與鑒定，結(jié)果顯示在TSA培養(yǎng)基上并沒(méi)有明顯的、特異的加德納氏菌菌落生長(zhǎng)，而全部是質(zhì)地疏松、不透明、呈現(xiàn)或松或緊的蜘蛛網(wǎng)、絨毛狀的真菌菌落，如圖3 所示。

圖3 菌落形態(tài)特征Fig.3 Colony morphological characterisitcs

2.4 犬腺病毒檢測(cè)結(jié)果

利用PCR方法對(duì)采集的臟器和血液進(jìn)行了檢測(cè)，均未檢測(cè)到犬腺病毒（CAV），結(jié)果如圖4 所示，說(shuō)明此次狐貍流產(chǎn)不是由犬傳染性肝炎感染引起的。

圖4 犬腺病毒PCR 檢測(cè)結(jié)果Fig.4 PCR test result of canine adenovirus

2.5 霉菌毒素ELISA檢測(cè)

2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 共檢測(cè)了5 種霉菌毒素，分別為黃曲霉毒素總量、伏馬毒素、T-2 毒素、赭曲霉素和玉米赤酶烯酮。根據(jù)ELISA檢測(cè)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)操作程序，繪制了5 種霉菌毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖5 所示。根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出R2值均在0.95 以上，可用于霉菌毒素含量的測(cè)定。

圖5 霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 5 Standard curve of mycotoxin

2.5.2 樣品中霉菌毒素含量的測(cè)定及計(jì)算 根據(jù)每一種霉菌毒素ELISA檢測(cè)試劑盒的操作流程，對(duì)流產(chǎn)狐貍肝臟、胃、腸系膜淋巴結(jié)、脾臟進(jìn)行了霉菌毒素檢測(cè)。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)各樣品的OD450 nm 值，將其帶入圖 5中相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出霉菌毒素的含量（需要乘以樣品的稀釋倍數(shù)），結(jié)果見(jiàn)表1。由表1 可知，在流產(chǎn)狐貍的肝臟、脾臟、淋巴結(jié)與胃中均檢測(cè)到黃曲霉毒素總量（AFT）分別為5.813、7.261、6.937、7.017g/kg，而其他霉菌毒素檢測(cè)值均較低。

表1 樣品中毒素含量Table 1 The toxin content in samples （g/kg）

表1 樣品中毒素含量Table 1 The toxin content in samples （g/kg）

霉菌毒素 Mycotoxins 肝臟 Liver 胃 Stomach 淋巴結(jié) Lymph nodes 脾臟 Spleen黃曲霉毒素總量 Aflatoxin total amount 5.813 7.261 6.937 7.017伏馬毒素 Fumonisin 0 0 0 0 T-2 毒素 T-2 toxin 0 0 0 0赭曲毒素 Ochratoxin 0 0 0 0玉米赤霉烯酮 Zearaleaone 0 0 0 0

3 討論

該試驗(yàn)通過(guò)對(duì)流產(chǎn)母狐進(jìn)行臨床觀察、病理剖檢和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)，再結(jié)合對(duì)死亡狐貍飼料采食情況的分析，可確定引起此次狐貍流產(chǎn)的病因?yàn)辄S曲霉毒素中毒。主要原因可能是由于該養(yǎng)殖場(chǎng)的狐貍采食了被黃曲霉毒素污染的飼料而引起的慢性蓄積性中毒所造成的。

由于引起狐貍流產(chǎn)的原因較多，加上黃曲霉毒素中毒屬于蓄積性中毒，平時(shí)很難發(fā)現(xiàn)，等發(fā)現(xiàn)后就很難得到糾正，這就造成近年來(lái)因霉菌毒素中毒而引起的流產(chǎn)經(jīng)常發(fā)生。尤其是引起狐貍等毛皮動(dòng)物流產(chǎn)，一旦發(fā)現(xiàn)就會(huì)發(fā)生大面積流產(chǎn)、無(wú)法控制和損失慘重[15-17]。

黃曲霉毒素是霉菌毒素中毒性最大、對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物健康危害極為突出的一類(lèi)霉菌毒素[18]。近年來(lái)，在家禽、豬、牛和羊等畜禽中均有發(fā)生，給養(yǎng)殖企業(yè)帶來(lái)了嚴(yán)重的損失。黃曲霉菌廣泛存在于自然界中，玉米、大豆、花生和豆餅等容易繁殖黃曲霉菌，進(jìn)而產(chǎn)生黃曲霉毒素。據(jù)報(bào)道，每粒嚴(yán)重發(fā)霉含黃曲霉毒素40g的玉米，可令2 只小鴨中毒死亡，該物質(zhì)的毒性比毒藥氰化鉀要強(qiáng)10 倍，1g/kg即可誘發(fā)癌變。當(dāng)動(dòng)物采食受污染的飼料時(shí)，輕則可能出現(xiàn)發(fā)熱、嘔吐、腹瀉、食欲減退等癥狀，重則可能出現(xiàn)生產(chǎn)停滯、肢體浮腫、共濟(jì)失調(diào)和流產(chǎn)死胎等。對(duì)人和畜禽的主要中毒表現(xiàn)在神經(jīng)和內(nèi)分泌紊亂、免疫抑制、致癌、致畸、肝腎損傷和繁殖障礙等[18]。雞天生對(duì)黃曲霉毒素敏感，飼料中較低的毒素含量就會(huì)造成雞群大量死亡[19]。毒素對(duì)蛋雞的影響集中表現(xiàn)為卵巢和輸卵管萎縮、產(chǎn)蛋量下降、產(chǎn)畸形蛋、采食量減少、生產(chǎn)性能下降、飼料報(bào)酬降低及種蛋孵化率降低[19-21]。

黃曲霉毒素對(duì)豬的危害也很?chē)?yán)重，飼料中如果黃曲霉毒素超過(guò)200g/kg 時(shí)就會(huì)表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，如生長(zhǎng)受阻、免疫抑制等[22-23]。如果飼料中黃曲霉毒素達(dá)到1 200～2 000g/kg 時(shí)就會(huì)出現(xiàn)黃疸、精神沉郁、厭食和死亡等癥狀。然而，此次檢測(cè)發(fā)現(xiàn)狐貍的肝臟、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)及胃內(nèi)的黃曲霉毒素含量分別為 5.813、7.261、6.937 和 7.017g/kg。這個(gè)檢測(cè)結(jié)果要比引起豬中毒的數(shù)值低得多，說(shuō)明狐貍對(duì)黃曲霉毒素可能要比豬敏感。

近年來(lái)，狐貍流產(chǎn)的發(fā)病率不斷增高，有些養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)病率高達(dá)50%～70%，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。然而，人們一直在關(guān)注由病原微生物感染、營(yíng)養(yǎng)不良和維生素缺乏引起的流產(chǎn)，而忽視了霉菌毒素尤其是黃曲霉毒素中毒引起的流產(chǎn)。通過(guò)該研究可使人們清晰認(rèn)識(shí)到黃曲霉毒素中毒在引起狐貍流產(chǎn)的因素中確實(shí)很?chē)?yán)重、危害很大。由于黃曲霉毒素廣泛存在于土壤、動(dòng)植物和各種堅(jiān)果中，特別容易污染花生、玉米、稻米、大豆和小麥等糧油產(chǎn)品[23-24]。經(jīng)過(guò)此次現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，該狐貍場(chǎng)發(fā)生狐貍流產(chǎn)的原因就是由于谷物性飼料發(fā)霉變質(zhì)導(dǎo)致的。由于狐貍飼喂膨化玉米，發(fā)霉后很難被發(fā)現(xiàn)，這也是近年來(lái)狐貍流產(chǎn)多發(fā)卻找不到流產(chǎn)原因的根本原因。

4 防控措施

4.1 杜絕飼喂發(fā)霉變質(zhì)的飼料

要嚴(yán)格把控狐貍谷物性飼料的質(zhì)量關(guān)，尤其是膨化玉米、小麥粉等飼料。杜絕使用發(fā)霉的谷物性飼料飼喂動(dòng)物，控制飼料加工、配制和運(yùn)輸?shù)拳h(huán)節(jié)，控制飼料的儲(chǔ)存環(huán)境，盡量縮短儲(chǔ)存時(shí)間，防止飼料飼喂期間發(fā)霉變質(zhì)[19]。

4.2 合理使用飼料防霉劑

飼料防霉劑要具備抑制霉菌生長(zhǎng)，但又對(duì)動(dòng)物無(wú)毒的特點(diǎn)[25]。因此，作為飼料防霉劑，必須符合以下3個(gè)原則：一是具有較強(qiáng)的廣譜抑菌效果；二是pH值低，在低水分飼料中能釋放出來(lái)；三是操作方便，使用安全、經(jīng)濟(jì)、無(wú)致癌、致畸和致突變作用[25-26]。另外還要求在有效添加量范圍內(nèi)不影響動(dòng)物健康及飼料的適口性。目前，常用的防霉劑主要有以下3 大類(lèi)：第1 類(lèi)為有機(jī)酸，如丙酸、山梨酸、苯甲酸、乙酸、脫氫醋酸和富馬酸等；第2 類(lèi)為有機(jī)酸鹽及其酯，如丙酸鹽、山梨酸鈉（鉀）、苯甲酸鈉和富馬酸二甲酯等[12]；第3 類(lèi)為復(fù)合防霉劑。有機(jī)酸防霉效果較好，但腐蝕性較大。有機(jī)酸鹽的防霉效果較有機(jī)酸差，且必須在有一定的水分和一定pH 值的條件下才能進(jìn)行，但腐蝕性??；復(fù)合防霉劑防霉效果作用強(qiáng)、腐蝕性小[27-28]。

4.3 霉菌毒素中毒的治療

更換飼料無(wú)疑是最有效解決霉菌中毒的方法，在提供無(wú)污染的飼料后再使用一定量的霉毒清或制霉菌素，大多數(shù)霉菌毒素中毒的狐貍會(huì)很快恢復(fù)健康[27]。此外，補(bǔ)充維生素（如維生素E 和維生素C 等）可以部分抑制T-2 毒素和赭曲毒素對(duì)狐貍的毒害[28]。N-乙酰半胱氨酸和硫胺也能降低黃曲霉毒素的毒性，其原因是增加了谷胱甘肽的合成。