博落回的性狀及其飲片品質(zhì)特征

陳志琳， 杜洪志， 伍莎莎， 張 靜， 李 瑋

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550025)

博落回為罌粟科植物博落回〔Macleayacordata(Willd.) R.Br.〕的干燥全草，其性味苦、寒、大毒，具有清熱解毒，活血散瘀，殺蟲止癢的功效，用于風(fēng)濕痹痛，跌打損傷，癰腫瘡毒，下肢潰瘍，頑癬，陰癢。使用方法主要是外用，搗爛敷，煎水熏洗，乙醇浸漬液涂搽[1]。其主要活性成分為生物堿，至今已被分離鑒定的生物堿達(dá)74個(gè)，其含量最高且活性較強(qiáng)的為苯胼異喹啉類生物堿，主要包括血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿和別隱品堿等[2-4]。博落回具有抗菌消炎、殺蟲止癢、改善肝功能、增強(qiáng)免疫功能、抗腫瘤等藥理作用[5-10]。博落回為貴州省特色民族藥，因其具有良好的抗菌消炎、散淤止痛之功，在少數(shù)民族地區(qū)應(yīng)用廣泛。2003年版《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》中僅對(duì)其植物的性狀、薄層鑒別、功能主治等進(jìn)行簡(jiǎn)要描述，其質(zhì)量控制指標(biāo)不完善，不能全面、有效控制該藥材質(zhì)量。

近年來，博落回在養(yǎng)豬業(yè)、養(yǎng)禽業(yè)和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)方面均有良好應(yīng)用效果[11]，且還作為原料制備相關(guān)醫(yī)藥制劑[12]，開發(fā)前景良好。目前，有關(guān)博落回質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究較少。為進(jìn)一步保障博落回質(zhì)量及相關(guān)制劑安全有效、穩(wěn)定可控，以博落回為研究對(duì)象，采用薄層色譜法和高效液相色譜法，建立博落回的薄層鑒別方法和血根堿的含量測(cè)定方法，參照2015年版《中國藥典》(4部)要求，測(cè)定博落回飲片的水分、灰分、浸出物含量，并初步建立博落回飲片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以期為博落回更好地開發(fā)利用及其藥材的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

對(duì)照品：血根堿(批號(hào)：510001-201101，純度：99.3%)，中國食品藥品檢定研究院。

博落回樣品：共10批，分別采自貴州黔東南州凱里市雷山縣西江鎮(zhèn)和廣西壯族自治區(qū)全州縣安和鎮(zhèn)等地，其樣品信息見表1。經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室鑒定為罌粟科博落回屬植物博落回的帶根全草，藥材根切厚片，莖切短段，葉于60℃烘箱烘干，備用。

表1 10批博落回飲片信息Table 1 Information on 10 batches of M. cordata decoction pieces

儀器：LC-20 AT型高效液相色譜儀，日本島津；色譜柱Sino Chrom ODS-BP C18(4.6 mm×250 mm)，上海月旭科技股份有限公司；TU-1810PC型紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；AUW220D型全自動(dòng)電子分析天平，上海梅特勒-托利多儀器有限公司；BX41顯微鏡、DP顯像系統(tǒng)日本OLYMPUS公司。

試劑：乙腈，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸(色譜純)，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；水為娃哈哈純凈水；水合氯醛(分析純批號(hào)20161121)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；甘油(分析純批號(hào)20161113)，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司；冰醋酸(批號(hào)20160701)，重慶川東化工集團(tuán)有限公司，其余試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 藥材性狀鑒定 對(duì)采集的10批博落回全草的大小、顏色、形狀、斷面、質(zhì)地等特征進(jìn)行對(duì)比觀察和描述。

1.2.2 顯微鑒別 對(duì)采集的10批博落回樣品粉末用水合氯醛透化制片，應(yīng)用光學(xué)顯微鏡對(duì)其組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)等進(jìn)行觀察、測(cè)量和描述，并對(duì)有代表性的特征進(jìn)行拍照記錄。

1.2.3 薄層色譜鑒別 對(duì)照藥材及供試品藥材的制備。精密稱定博落回對(duì)照品約1.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，精密加入80%乙醇40 mL，靜置1 h，稱定重量，回流提取1 h，放冷，補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。同法制得供試品溶液。按照2015年版《中國藥典》4部薄層色譜法(通則0502)試驗(yàn)，分別取對(duì)照品和供試品溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-石油醚-丙酮(15∶10∶1)為展開劑，置氨蒸汽飽和的展開缸內(nèi)飽和20 min，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。

1.2.4 水分、灰分、浸出物的測(cè)定 水分測(cè)定按照2015年版《中國藥典》(4部，通則 0832)水分測(cè)定法第2法烘干法測(cè)定，灰分測(cè)定按照2015年版《中國藥典》(4部，通則2302)灰分測(cè)定法測(cè)定，浸出物按照2015年版《中國藥典》(4部，通則2201)浸出物測(cè)定法采用熱浸法測(cè)定，50%乙醇作為提取溶劑。每批樣品平行測(cè)定3份。

1.2.5 血根堿的含量測(cè)定

1) 對(duì)照品溶液的配制。將血根堿對(duì)照品置于五氧化二磷減壓干燥器中干燥12 h，精密稱取血根堿對(duì)照品12.1 mg，置于50 mL容量瓶中，加80%乙醇溶液溶解至刻度，制成0.420 mg/mL的血根堿對(duì)照品。

2) 供試品溶液的制備。精密稱定博落回樣品粉末(過4號(hào)篩)約1.0 g，置于100 mL圓底燒瓶中，精密加入80%乙醇40 mL，靜置1 h，稱定重量，回流提取1 h，放冷，補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

3) 色譜條件。色譜柱，SinoChrom ODS-BP C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)；流動(dòng)相，乙腈-0.3%磷酸(29∶71)；檢測(cè)波長285 nm，流速1.2 mL/min；進(jìn)樣量10 μL，柱溫30℃。

4) 陰性對(duì)照及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。以乙醇為陰性對(duì)照溶液。取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10 μL，按色譜條件進(jìn)行測(cè)定。理論塔板數(shù)以血根堿計(jì)應(yīng)不小于6 000，分離度大于1.5。

5) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密吸取血根堿對(duì)照品溶液2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL和25 μL注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，以質(zhì)量為橫坐標(biāo)(X)，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，求回歸線性方程。

6) 精密度試驗(yàn)。精密吸取血根堿對(duì)照品溶液10 μL注入色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣6次，每次10 μL，記錄峰面積，計(jì)算RSD值。

7) 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一供試品溶液，在 0 h、3 h、6 h、9 h、12 h，分別進(jìn)樣10 μL，計(jì)算血根堿含量和RSD值。

8) 重復(fù)性試驗(yàn)。精密稱取同一批號(hào)的博落回粉末(過4號(hào)篩)，共6份，每份約1 g，供試品溶液制備方法制備，進(jìn)樣10 μL，計(jì)算血根堿含量和RSD值。

9) 加樣回收率試驗(yàn)。精密稱取博落回粉末約0.5 g，共6份，加入適量血根堿對(duì)照品，按供試品溶液的制備方法制備，分別進(jìn)樣10 μL，測(cè)平均回收率和RSD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 博落回的性狀特征

博落回根粗壯，棕褐色，有縱溝紋。莖圓柱形，直徑2～4 cm，中空，淺綠色，被白色粉霜，上部有分枝。單葉互生，具長柄；葉片皺縮，完整葉片展平后呈寬卵形或近圓形，5～9淺裂，裂片邊緣具不規(guī)則波狀齒，上表面淺綠色或灰綠色，下表面被白霜及細(xì)密茸毛。圓錐花序多頂生，殘存小花白色或淡紅色，易脫落。氣微，味苦。

2.2 博落回飲片粉末特征

博落回飲片粉末薄壁細(xì)胞中見草酸鈣簇晶，直徑為20～44 μm，有黃棕色團(tuán)塊，有淀粉粒，單粒類圓形，直徑2～10 μm，導(dǎo)管有網(wǎng)紋導(dǎo)管，梯紋導(dǎo)管，具緣紋導(dǎo)管，孔紋導(dǎo)管，非腺毛1～6個(gè)細(xì)胞，直徑6～28 μm，長55～297 μm(圖1)。

2.3 博落回飲片的薄層色譜圖

從圖2可知，10批博落回樣品的薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離度好，Rf值適當(dāng)。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的斑點(diǎn)。

2.4 博落回的水分、灰分及浸出物含量

從表2可知，不同產(chǎn)區(qū)10批博落回飲片的水分、總灰分、酸不溶性灰分、水溶性浸出物、醇溶性浸出物含量有一定差異，水分含量在10.42%～12.66%，平均為10.86%，其中，貴州凱里市西江鎮(zhèn)最高，貴陽市紅楓湖鎮(zhèn)最低；總灰分含量在5.08%～9.27%，平均為6.65%，其中，桂林市鳳凰鎮(zhèn)最高，貴州凱里市西江鎮(zhèn)最低；酸不溶性灰分含量在0.20%～1.55%，其中，貴陽市青巖鎮(zhèn)最高，桂林市安和鎮(zhèn)最低；水溶性浸出物含量在16.28%～29.59%，平均19.97%，其中，貴州凱里市西江鎮(zhèn)最高，貴陽市青巖鎮(zhèn)最低；醇溶性浸出物含量在18.35%～26.48%，平均為21.16%，其中，貴州凱里市西江鎮(zhèn)最高，桂林市安和鎮(zhèn)最低。

表2 10批博落回飲片樣品中的水分、灰分及浸出物測(cè)含量Table 2 Content of moisture, ash and extract in 10 batches of M. cordata decoction pieces %

2.5 博落回飲片中的血根堿含量

2.5.1 對(duì)照品及樣品色譜圖 從圖3看出，血根堿對(duì)照品和博落回樣品的相對(duì)保留時(shí)間基本一致，且成分分離良好，分離度大于1.5，均達(dá)到有效分離。

2.5.2 線性方程 根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，血根堿的線性方程為Y=52 010 048.78X+31 107.370 73，r=0.999 7，表明血根堿在進(jìn)樣含量為0.083～1.043 μg的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.3 精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性 根據(jù)精密度試驗(yàn)，血根堿的RSD為2.87%，表明測(cè)定儀器的精密度良好。根據(jù)重復(fù)性試驗(yàn)，血根堿的平均含量為0.61%，RSD為1.85%，表明測(cè)定血根堿方法的重復(fù)性良好。根據(jù)穩(wěn)定性試驗(yàn)血根堿的RSD為3.0%，表明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 加樣回收率 從表3可知，血根堿的平均回收率為102.24%，RSD為2.43%，說明測(cè)定方法準(zhǔn)確性良好。

表3 血根堿的加樣回收率(n=6)Table 3 Recovery of sanguinarine(n=6)

2.5.5 10批博落回樣品中的血根堿含量 從表4可知，貴州、廣西不同地區(qū)博落回中均能檢測(cè)出血根堿，且各成分含量存在一定差異。血根堿含量為0.27%～0.71%，平均為0.43%，以貴州凱里市雷山縣西江鎮(zhèn)的最高，為0.712 6%。

表4 10批博落回樣品中的血根堿的含量Table 4 Content of sanguinarine in 10 batches of M. cordata decoction pieces %

3 結(jié)論與討論

研究表明，在乙腈-0.3%磷酸水溶液(29∶71)梯度洗脫，流速為1.2 mL/min ，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為30℃，檢測(cè)波長為285 nm條件下檢測(cè)所得色譜峰的峰形對(duì)稱、分離度高。通過方法的研究及系統(tǒng)方法學(xué)考察，所建立的含量測(cè)定方法專屬性強(qiáng)、合理可行。

經(jīng)測(cè)定，10批博落回樣品的的水分含量為10.42%～12.66%，平均10.86%；總灰分含量為5.08～9.27%，平均6.66%；酸不溶性灰分含量為0.20%～1.57%，平均0.61%；醇溶性浸出物含量為18.35%～26.48%，平均21.16%，水溶性浸出物含量為16.42%～29.59%，平均19.97%；血根堿含量為0.27%～0.71%，平均0.43%。

初步擬定水分、總灰分、酸不溶性灰分檢查項(xiàng)按平均值的120%設(shè)限，建議擬定標(biāo)準(zhǔn)為水分≤13.0%，總灰分≤8.0%，酸不溶性灰分≤0.70%。浸出物以平均值的80%為限，擬定浸出物≥17.0%。血根堿的含量以平均值的80%設(shè)限，為0.20%，故擬定按干燥品計(jì)算，含血根堿(C20H14NO4)≥0.20%。

在建立薄層色譜鑒別方法時(shí)，以血根堿為對(duì)照，不僅專屬性強(qiáng)，且能夠多成分全面反映其質(zhì)量。在進(jìn)行展開劑考察時(shí)發(fā)現(xiàn)，氯仿-石油醚-丙酮不加甲醇展開斑點(diǎn)較多，且比較清晰，但分離效果不理想，加入極性較小的石油醚調(diào)極性后分離度得到很大改善；考察不同比例得出以氯仿-石油醚-丙酮(15∶10∶1)為展開劑展開斑點(diǎn)清晰可見，Rf值適當(dāng)。

博落回藥材藥效成分主要以異喹啉類生物堿為主，故可按烘干法測(cè)定水分。生物堿類成分易溶于乙醇，控制醇浸出物含量，對(duì)確保藥材樣品質(zhì)量穩(wěn)定具有重要意義。檢測(cè)博落回藥材樣品總灰分和酸不溶性灰分含量，可控制藥材樣品中泥土、砂石等外來無機(jī)物的量，對(duì)確保藥材樣品凈度具有重要意義。

血根堿是博落回有效成分之一，現(xiàn)代藥理研究表明，血根堿具有抑制血管平滑肌收縮、抑腫瘤、抗真菌的作用[10-12]。將血根堿作為博落回飲片質(zhì)量控制指標(biāo)對(duì)保證博落回飲片質(zhì)量具有重要意義，研究采用HPLC測(cè)定血根堿含量，方法簡(jiǎn)便快捷，可用于博落回中血根堿的含量測(cè)定。