高節(jié)竹竹葉次生代謝產(chǎn)物和土壤微生物的季節(jié)變化及其相關(guān)性1)

徐小博 徐萍 岳永德 湯鋒 王進(jìn) 荀航

(新鄉(xiāng)學(xué)院，新鄉(xiāng)，453000) (國(guó)際竹藤中心)

土壤因子和植物次生代謝產(chǎn)物存在密切關(guān)系，一方面，植物在生長(zhǎng)過程中會(huì)對(duì)土壤微生物產(chǎn)生影響，例如植物通過植物地上部分的淋洗和揮發(fā)、根的分泌及植物殘?bào)w的腐解等途徑可以將體內(nèi)的次生代謝產(chǎn)物釋放到土壤中，對(duì)其它植物、土壤動(dòng)物和微生物的生長(zhǎng)發(fā)育造成[1-3]。另一方面，微生物可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，特別是有益菌，有利于植物營(yíng)養(yǎng)吸收和植物代謝產(chǎn)物，保護(hù)植物抵抗各種土傳病原菌，并能幫助植物適應(yīng)許多環(huán)境壓力，緩解非生物脅迫[4-5]。此外，植物土壤微生物也可通過降解土壤中的化感物質(zhì)，干擾植物和化感成分之間的作用[6]。竹子是重要的森林資源，竹葉中的次生代謝產(chǎn)物與土壤微生物群落的關(guān)系，值得深入研究。關(guān)于竹葉次生代謝產(chǎn)物隨時(shí)間變化已有相關(guān)報(bào)道，并對(duì)毛竹、小琴絲竹等竹種的竹葉中的酚類物質(zhì)、黃酮、內(nèi)酯等次生代謝產(chǎn)物變化進(jìn)行了研究[7-10]，但缺少對(duì)具體次生代謝產(chǎn)物變化的研究。

高節(jié)竹(Phyllostachysprominens)為禾本科竹亞科剛竹屬重要經(jīng)濟(jì)竹種，是一種集觀賞、生態(tài)防護(hù)、筍用、材用于一體的多用竹種，分布廣，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高[11]。本研究以不同時(shí)期的高節(jié)竹竹林土壤為研究對(duì)象，測(cè)定高節(jié)竹葉次生代謝產(chǎn)物以及竹林土壤3大微生物群落的季節(jié)動(dòng)態(tài)變化。分析高節(jié)竹葉次生代謝產(chǎn)物和土壤微生物群落季節(jié)變化特征，探討次生代謝產(chǎn)物的變化與土壤微生物群落的相互聯(lián)系，為高節(jié)竹竹林的可持續(xù)發(fā)展提供技術(shù)支持。

1 研究地概況

研究地位于浙江省杭州市富陽區(qū)永昌鎮(zhèn)(119°25′～120°19.5′E、29°44～30°11′N)，該地屬中亞熱帶季風(fēng)氣候，溫暖濕潤(rùn)，四季分明。年平均氣溫16.1 ℃，7月平均氣溫28.1 ℃，1月平均氣溫3.8 ℃，極端高溫41.3 ℃，極端低溫-12.3 ℃，10 ℃積溫5 100 ℃，多年平均無霜期232 d。年降水量1 426 mm，降水量隨季節(jié)變化，7—8月為季節(jié)性干旱期。年平均蒸發(fā)量1 392 mm，年平均相對(duì)濕度79%，年日照時(shí)間為1 850～1 950 h。

2 材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

竹葉樣本：在采樣地選擇一片長(zhǎng)勢(shì)良好的2年生高節(jié)竹竹林中，分別設(shè)置3個(gè)20 m×20 m的樣方，每個(gè)樣方中隨機(jī)設(shè)置3個(gè)3 m×3 m的小樣方。在每個(gè)小樣方采集竹葉，采集植株上、中、下部的健康葉片，然后混勻，樣品自然陰干至恒質(zhì)量，粉碎后，放置在冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆?。竹葉采樣時(shí)間在2018年1、3、5、7、9和11月份的中旬。

土壤樣本：在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)分別選擇100 m2的高節(jié)竹竹林地設(shè)置為固定樣方。不同時(shí)期土壤特征樣本，采樣時(shí)間為2018年1、3、5、7、9和11月份的中旬；土壤微生物和土壤酶的樣本，采樣時(shí)間為9月15日左右。在每個(gè)樣地內(nèi)布設(shè)的5個(gè)土樣采集點(diǎn)，每樣點(diǎn)3個(gè)重復(fù)，采集0～20 cm深度的土壤樣品，取樣時(shí)去除土壤表層凋落物及其他雜物，并剔除土壤中植物根系和石塊。每個(gè)樣品采樣量為1.0 kg左右，裝入無菌袋放置帶冰塊的泡沫箱內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室，貯存于冰箱內(nèi)4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

對(duì)照品(異葒草苷、葒草苷、對(duì)香豆酸、牡荊苷、異牡荊苷、蘆丁、木犀草苷、苜蓿素7-O-葡萄糖苷、木犀草素、芹菜素(純度>98%))購(gòu)于上海源葉生物生物技術(shù)有限公司，色譜試劑購(gòu)于美國(guó)Fisher公司。

2.2 竹葉次生代謝物的檢測(cè)

高效液相色譜檢測(cè)方法參考魏琦等[12]方法，準(zhǔn)確稱取竹葉粉2.0 g于50 mL離心管中，加入體積分?jǐn)?shù)70%乙醇30 mL，超聲提取30 min，過濾，重復(fù)提取3次，合并上清液，并濃縮。用50 mL水懸浮于分液漏斗中，加50 mL石油醚萃取，重復(fù)3次，將下層水溶液濃縮，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶解于10 mL容量瓶中，定容至刻度，過0.45 μm微孔濾膜待測(cè)。每個(gè)樣品做3次重復(fù)。高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)條件：色譜柱為Inertsil ODS-3 C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流動(dòng)相為乙腈和體積分?jǐn)?shù)0.5%磷酸水溶液，梯度洗脫，洗脫方法見表1；流速為1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為340 nm；進(jìn)樣量為10 μL。利用樣品中對(duì)應(yīng)的峰面積計(jì)算竹葉中被檢測(cè)成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

表1 高效液相色譜方法中的梯度洗脫方法

2.3 土壤微生物數(shù)量測(cè)定

細(xì)菌數(shù)量測(cè)定參考許光輝等[13]和王理德等[14]的方法，將混合均勻的土樣稀釋至10-6，分別取0.1 mL濃度梯度為10-4、10-5、10-6土壤溶液涂布至細(xì)菌選擇培養(yǎng)基(牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)，培養(yǎng)溫度37 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為1～2 d，以平板表面涂抹法計(jì)數(shù)。

真菌數(shù)量測(cè)定參考王理德等[14]的方法，分別取0.1 mL濃度梯度為10-2、10-3、10-4土壤溶液涂布至真菌選擇培養(yǎng)基(馬丁-孟加拉紅培養(yǎng)基)，培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為2～3 d，以平板表面涂抹法計(jì)數(shù)。

放線菌數(shù)量測(cè)定參考王理德等[14]的方法，分別取0.1 mL濃度梯度為10-2、10-3、10-4土壤溶液涂布至放線菌選擇培養(yǎng)基(改良高氏一號(hào)培養(yǎng)基)，培養(yǎng)溫度28 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為3～5 d，以平板表面涂抹法計(jì)數(shù)。

微生物數(shù)量用每克樣品的菌落數(shù)(菌落·g-1)表示，每克樣品的菌落數(shù)=同一個(gè)稀釋度幾次重復(fù)的菌落平均數(shù)×5×稀釋倍數(shù)。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010計(jì)算數(shù)據(jù)平均值、標(biāo)準(zhǔn)差等，并完成圖表制作。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行Pearson法相關(guān)分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 竹葉中10種次生代謝產(chǎn)物的檢測(cè)結(jié)果

由圖1可知，按照實(shí)驗(yàn)的高效液相色譜條件，50 min內(nèi)對(duì)10種次生代謝產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)良好分離。由表2可知，試驗(yàn)方法進(jìn)一步通過回歸方程、R2、最小檢出量(LOD)及最低測(cè)定質(zhì)量分?jǐn)?shù)(LOQ)進(jìn)行確證。10種次生代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品在線性范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系；10種次生代謝產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品的LOD值在0.01～0.03 mg·kg-1，LOQ值在0.02～0.34 mg·kg-1。

表2 10種次生代謝產(chǎn)物的質(zhì)量濃度和峰面積的線性關(guān)系

3.2 高節(jié)竹竹葉次生代謝產(chǎn)物的時(shí)間變化

由表3、圖2、圖3可知，異葒草苷、葒草苷、對(duì)香豆酸、牡荊苷、異牡荊苷、蘆丁、木犀草苷和苜蓿素7-O-葡萄糖苷等8種次生代謝物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)峰值出現(xiàn)在1月份或11月份。異葒草苷和對(duì)香豆酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高出現(xiàn)在1月份，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為4.661 2、0.025 1 mg·g-1，與其他月份差異極顯著；木犀草苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)在11月份最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.359 1 mg·g-1，顯著高于其他月份；苜蓿素7-O-葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最高值出現(xiàn)在11月份，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.698 0 mg·g-1。

表3 不同時(shí)間竹葉次生代謝產(chǎn)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)的變化 mg·g-1

從1月份開始，異葒草苷、葒草苷、對(duì)香豆酸、牡荊苷、異牡荊苷、蘆丁和苜蓿素7-O-葡萄糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)均降低，其中異葒草苷、葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷、蘆丁的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低值出現(xiàn)的7月份。苜蓿素7-O-葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)的最低值出現(xiàn)在5月份，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.054 1 mg·g-1；對(duì)香豆酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最低值出現(xiàn)在9月份，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.007 9 mg·g-1。芹菜素在1年中質(zhì)量分?jǐn)?shù)變化趨勢(shì)為先升高后降低。高節(jié)竹竹葉中僅在5月份檢測(cè)到木犀草素，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.007 9 mg·g-1。

從被檢測(cè)的10種次生代謝的總量看，1月份質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高(6.601 7 mg·g-1)，1—7月份，被檢測(cè)物總量逐漸降低，7月最低(1.044 0 mg·g-1)，然后逐漸上升，11月份總量上升至5.624 3 mg·g-1。

3.3 高節(jié)竹竹林土壤微生物群落的時(shí)間變化

由表4可知，微生物3大類群隨時(shí)間均具有明顯動(dòng)態(tài)變化。土壤中細(xì)菌為優(yōu)勢(shì)種群，細(xì)菌數(shù)量占微生物總數(shù)的98.88%～99.69%。3月份土壤放線菌數(shù)量高于土壤真菌數(shù)量，3月份土壤放線菌占總微生物數(shù)量比例為0.65%，而1、5、7、9、11月份的土壤真菌數(shù)量高于土壤放線菌數(shù)量。

表4 高節(jié)竹竹林土壤微生物數(shù)量的季節(jié)變化

一年中，不同時(shí)期高節(jié)竹竹林土壤細(xì)菌數(shù)量差異顯著(P<0.05)，7月份土壤細(xì)菌數(shù)量最多，細(xì)菌數(shù)量為24.91×106菌落·g-1，分別是1、3、9月份土壤細(xì)菌的7.12、3.01、2.69倍，說明土壤微生物生長(zhǎng)繁殖隨季節(jié)變換而變化，夏季雨熱同期，更有利于細(xì)菌生存。土壤真菌數(shù)量最大值出現(xiàn)在5月份(7.23×104菌落·g-1)，7月份土壤真菌數(shù)量為5.27×104菌落·g-1，顯著低于5月份，1月份和11月份土壤真菌數(shù)量最低，數(shù)量分別是2.88×104、2.73×104菌落·g-1，但兩月份之間的差異不顯著，說明土壤真菌和細(xì)菌一樣，在冬季生長(zhǎng)繁殖不旺盛；放線菌數(shù)量隨季節(jié)變化同樣表現(xiàn)出顯著差異，春夏季放線菌數(shù)量較高，5月份放線菌數(shù)量最高(6.75×104菌落·g-1)，依次分別是3、7、11、9月份，1月份放線菌數(shù)量?jī)H為0.71×104菌落·g-1。

3.4 高節(jié)竹竹葉次生代謝物的變化與土壤微生物群落的關(guān)系

由表5可知，次生代謝物總量和細(xì)菌數(shù)量、微生物總量均呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；異葒草苷與細(xì)菌數(shù)量、微生物總量均呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；苜蓿素與真菌總量顯著負(fù)相關(guān)，芹菜素與放線菌變化呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(P<0.01)。

表5 竹葉次生代謝產(chǎn)物和土壤微生物群落變化的相關(guān)性

4 結(jié)論與討論

季節(jié)的變化也是影響植物體內(nèi)次生代謝產(chǎn)物積累的重要因素。本研究發(fā)現(xiàn)次生代謝產(chǎn)物主要為黃酮類次生代謝產(chǎn)物，次生代謝物總量最大值出現(xiàn)在1月份，最小值出現(xiàn)在7月份。與蘇春花等[10]研究的結(jié)果基本一致，但與呂兆林等[9]研究結(jié)果不一致，原因是不同竹種對(duì)環(huán)境的響應(yīng)不同。鄧波等[15]發(fā)現(xiàn)青錢柳中，黃酮類次生代謝產(chǎn)物的含量在8月和10月明顯高于其他季節(jié)；徐麗嬌等[16]發(fā)現(xiàn)黃檗中小檗堿含量隨著季節(jié)變化在各部位呈現(xiàn)夏季升高，秋季下降的趨勢(shì)，而藥根堿在不同部位中的含量也隨著季節(jié)變化而有不同的規(guī)律，秋季積累量最大。研究發(fā)現(xiàn)高節(jié)竹竹葉中次生代謝物在秋冬季高，而在春夏季低，原因是由春季到夏季，竹子枝葉生長(zhǎng)活動(dòng)旺盛，光合作用加強(qiáng)，體內(nèi)的有機(jī)物主要用于初生代謝，次生代謝較弱；進(jìn)入秋季呼吸減慢，生長(zhǎng)抑制劑增多，環(huán)境不利于竹子生長(zhǎng)，次生代謝產(chǎn)物合成加強(qiáng)并不斷積累。

土壤微生物在“土壤-土壤微生物-植物”生態(tài)系統(tǒng)中扮演重要角色。土壤微生物在土壤能量轉(zhuǎn)化及養(yǎng)分積累過程中發(fā)揮著重要作用。土壤細(xì)菌主要參與土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化，真菌與放線菌主要參與土壤有機(jī)物質(zhì)的分解。研究表明土壤有益真菌具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育和提供植物無機(jī)營(yíng)養(yǎng)的作用[5，17]，在緩解鹽壓力引起的毒性發(fā)揮重要作用，因此，通過基本營(yíng)養(yǎng)的供應(yīng)使得植物吸收機(jī)理正?；Ｕ婢饕纸饫w維素、果膠和木質(zhì)素等，放線菌對(duì)氨基酸等蛋白物質(zhì)更高效地分解[18]。土壤微生物數(shù)量與其所處土壤環(huán)境的變化密切聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)土壤3大類微生物數(shù)量基本都是細(xì)菌最高，放線菌次之，真菌最低，這表明細(xì)菌是優(yōu)勢(shì)菌，這個(gè)結(jié)論與譚宏偉等[19]、王理德等[14]的研究結(jié)果一致。

不同季節(jié)土壤細(xì)菌數(shù)量差異顯著，夏季土壤細(xì)菌數(shù)量最多，7月份細(xì)菌數(shù)量達(dá)到24.91×106菌落·g-1。真菌數(shù)量最大值出現(xiàn)在5月份；放線菌數(shù)量隨季節(jié)變化顯著差異，春夏季放線菌數(shù)量是秋冬季的3～6倍左右。春季溫濕適宜，植物群落開始恢復(fù)生長(zhǎng)，土壤表層存在大量未分解的動(dòng)植物殘?bào)w，凋落物的分解需要借助腐殖質(zhì)部分的有機(jī)物質(zhì)來促進(jìn)非腐殖質(zhì)部分的降解，真菌和放線菌可破壞凋落物表層，幫助大量?jī)?nèi)居性菌類侵入凋落物內(nèi)部，分解土壤中的有機(jī)物質(zhì)，供給植物吸收生長(zhǎng)，因此春季土壤養(yǎng)分和真菌、放線菌數(shù)量均較高；夏季高溫多雨，植物群落處于生長(zhǎng)旺盛時(shí)期，植物根系分泌物增多，土壤養(yǎng)分循環(huán)與能量流動(dòng)加快，需要大量的細(xì)菌參與其中，因此夏季微生物數(shù)量及代謝活性最高。這與相關(guān)的研究結(jié)果一致[20-22]。

竹葉的代謝產(chǎn)物豐富，竹葉凋落物在降解過程中會(huì)釋放化學(xué)物質(zhì)，包括很多的化感物質(zhì)[23]。研究竹林對(duì)土壤微生物群落及其生態(tài)功能的影響，對(duì)于全面科學(xué)地評(píng)價(jià)竹林的生態(tài)學(xué)特性，揭示竹林對(duì)生態(tài)系統(tǒng)生物地球化學(xué)循環(huán)的機(jī)理具有重要意義。在杉木林、桉樹林等樹種中，關(guān)于植物次生代謝產(chǎn)物對(duì)土壤微生物群落的影響研究表明，1月份和11月份竹葉微生物活動(dòng)較弱，除了溫度等影響外，這段時(shí)期葉片中含有較多次生代謝物，這些物質(zhì)可通過凋落物分解進(jìn)入土壤，并在土壤中不斷積累，抑制某些微生物的活性[24-25]。7月份微生物數(shù)量為全年最高，由于7月份的竹葉中次生代謝產(chǎn)物含量較少，對(duì)微生物不僅沒有抑制作用，而且有一定的促進(jìn)作用，由于這段時(shí)期葉片的加入，為土壤微生物提供了豐富的能量來源，提高了微生物活性[26-27]。說明植物體內(nèi)次生代謝物的量和土壤微生物存著相互關(guān)系，一方面植物釋放的化學(xué)物質(zhì)對(duì)土壤微生物群落表現(xiàn)出抑制或促進(jìn)作用，另一方面，土壤微生物也會(huì)通過參與土壤有機(jī)質(zhì)分解、礦質(zhì)元素運(yùn)輸而影響植物自身次生代謝物的合成。