例析幾類與PCR引物有關(guān)的試題

李林

摘要 通過計(jì)算引物的數(shù)量、選擇引物的種類及設(shè)計(jì)引物的序列等幾類試題的分析，加深對(duì)PCR技術(shù)過程及應(yīng)用的理解，提高學(xué)生解題能力及高考備考水平。

關(guān)鍵詞 例析 分類 PCR引物

中圖分類號(hào)C633. 91

文獻(xiàn)標(biāo)志碼B

PCR技術(shù)是高考考查的重點(diǎn)難點(diǎn)內(nèi)容之一，試題種類多，難度大，給學(xué)生的學(xué)習(xí)及備考帶來一定的困難。統(tǒng)計(jì)近幾年江蘇高考及江蘇各大市模擬考試卷發(fā)現(xiàn)，主要考查與PCR引物相關(guān)的知識(shí)，現(xiàn)歸納分類及例析如下（題目來源原題節(jié)選或整理）。

1 計(jì)算引物的數(shù)量

【例1】目標(biāo)片段的DNA分子經(jīng)PCR反應(yīng)循環(huán)n次，共需要消耗引物的數(shù)量為

個(gè)。

分析：PCR反應(yīng)的原理是利用DNA雙鏈復(fù)制原理，PCR反應(yīng)循環(huán)n次就是DNA分子擴(kuò)增（復(fù)制）n次，產(chǎn)生DNA分子片段為2ⁿ個(gè)，單鏈為2ⁿ⁺¹，其中每條子鏈的合成均需要1個(gè)引物，而2條母鏈不需消耗引物，故共需要消耗引物的數(shù)量為2ⁿ⁺¹-2個(gè)。

參考答案：2ⁿ⁺¹-2。

【例2】運(yùn)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA分子時(shí)，需經(jīng)過變性一復(fù)性一延伸一重復(fù)過程，經(jīng)過4輪循環(huán)后，得到的子代DNA分子中，不同時(shí)含有兩種引物的DNA分子占____。

分析：經(jīng)過4輪循環(huán)擴(kuò)增后，得到的子代DNA分子數(shù)目為24（或16）個(gè)，由于PCR過程中每條子鏈的合成均需要1個(gè)引物，且每一輪產(chǎn)生的子鏈均可成為下一輪的模板，所以不含引物的鏈為母鏈，始終2條，并且分布在2個(gè)DNA分子中，其余DNA分子均由兩條方向相反（含有兩種引物）子鏈組成，故不同時(shí)含有兩種引物的DNA分子占1/8。

參考答案：1/8。

2選擇引物的種類

【例3】利用PCR技術(shù)可以擴(kuò)增目的基因，PCR反應(yīng)體系中除含緩沖液、模板DNA、dNrIP（包含dATP、dCTP、dCIP、dTTP）、引物以外，還應(yīng)含有Taq酶。引物應(yīng)選用圖l中的

（填圖中標(biāo)號(hào)）。

分析：引物是利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因的前提，合成的依據(jù)是目的基因兩端的核苷酸序列，PCR過程中兩個(gè)引物分別與目的基因兩端結(jié)合，延伸方向相反，結(jié)果擴(kuò)增出兩個(gè)引物間的DNA片段。

參考答案：AD。

[例4]為了篩選出轉(zhuǎn)入了重組質(zhì)粒的大腸桿菌，應(yīng)在篩選平板培養(yǎng)基中添加四環(huán)素，平板上長出的菌落，常用PCR鑒定，所用的引物組成為圖2中

。

分析：PCR鑒定目的基因的原理就是利用引物的特異性，添加特異性引物后看能否擴(kuò)增出目的基因產(chǎn)物，故選引物甲和引物丙。

參考答案：引物甲 引物丙

【例5】為鑒定篩選出的菌落中是否含有正確插入目的基因的重組質(zhì)粒，擬設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR鑒定。圖3所示為甲、乙、丙3條引物在正確重組質(zhì)粒中的相應(yīng)位置，PCR鑒定時(shí)應(yīng)選擇的一對(duì)引物是 ____ 。某學(xué)生嘗試用圖中另外一對(duì)引物從某一菌落的質(zhì)粒中擴(kuò)增出了400 bp片段，原因是____。

分析：如果利用一個(gè)擴(kuò)增目的基因的引物和一個(gè)擴(kuò)增質(zhì)粒的引物，這兩個(gè)引物位于重組質(zhì)粒兩側(cè)且方向相反，就能擴(kuò)增出正確插入的目的基因，如果插入方向相反，則沒有產(chǎn)物，故選擇乙丙。據(jù)圖3，若擴(kuò)增出的DNA片段為400 bp，則正好是選擇甲、乙作為引物后目的基因反向連接的結(jié)果，故原因是目的基因的反向連接。

參考答案：乙丙 目的基因的反向連接

3 設(shè)計(jì)引物的序列

【例6]為了便于擴(kuò)增的DNA片段與表達(dá)載體連接，需在引物的_____端加上限制性酶切位點(diǎn)，且常在兩條引物上設(shè)計(jì)加入不同的限制性酶切位點(diǎn)，使DNA片段能定向插入表達(dá)載體，減少自連。

分析：在PCR技術(shù)中，引物的3'末端必須與目的片段完全相配，引物的5'末端可以不與目的片段互補(bǔ)。在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，從引物的3 '端延伸DNA鏈，故限制性酶切位點(diǎn)相關(guān)序列應(yīng)加在引物的5'端。

參考答案：5。

[例7]定點(diǎn)突變技術(shù)是指通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）向目的基因片段中引入所需變化。GFP（綠色熒光蛋白）的發(fā)光基團(tuán)是第65至67位的三個(gè)氨基酸（絲氨酸一酪氨酸一甘氨酸），該發(fā)光基團(tuán)可利用定點(diǎn)突變技術(shù)使第66位酪氨酸換成組氨酸，即可發(fā)出更明亮的藍(lán)光，成為藍(lán)色熒光蛋白（圖4）。

（1）定點(diǎn)突變第一步得把突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)在引物上，據(jù)圖中信息人工合成短DNA引物應(yīng)包含的序列是________。

分析：定點(diǎn)突變一般設(shè)計(jì)在引物的中間位置，突變位點(diǎn)堿基不能與模板鏈互補(bǔ)配對(duì)，但兩側(cè)序列可以互補(bǔ)配對(duì)，在Taq酶的作用下完成PCR擴(kuò)增。由于第一輪產(chǎn)生的子鏈可以成為下一輪的模板，所以可以擴(kuò)增出含定點(diǎn)突變的DNA片段。據(jù)題意可知，使第66位酪氨酸換成組氨酸，只要將其對(duì)應(yīng)DNA模板鏈中的ATC變成GTG即可實(shí)現(xiàn)，故人工合成短DNA引物應(yīng)包含的序列是AGACTGCTC。

參考答案：ACACTGCTC。

【例8】如圖5是科研人員利用重組PCR技術(shù)將A基因和B基因連接在一起的過程，先分別對(duì)兩個(gè)基因進(jìn)行擴(kuò)增，除去多余引物后，將產(chǎn)物混合，再對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到融合基因。本實(shí)驗(yàn)PCR1和PCR2選擇的引物分別是 _____ 和____ ，圖中引物2或引物3設(shè)計(jì)的要求是

分析：PCR技術(shù)能擴(kuò)增出方向相反的兩個(gè)引物間的片段，據(jù)圖可知PCRI應(yīng)選擇引物1和引物2，PCR2應(yīng)選擇引物3和引物4。圖中顯示PCRI和PCR2得到的產(chǎn)物可以通過堿基互補(bǔ)配對(duì)形成重疊區(qū)段，由此可知引物2和引物3是具有互補(bǔ)末端的引物，同時(shí)既能與基因A末端配對(duì)又能與基因B末端配對(duì)，故引物2或引物3設(shè)計(jì)的要求是將兩個(gè)基因的末端序列設(shè)計(jì)在同一引物中。

參考答案：引物1 引物2 引物3 引物4將兩個(gè)基因的未端序列設(shè)計(jì)在同一引物中