益生菌抗熱牛蒡復(fù)合保護劑篩選優(yōu)化研究

崔莉 潘超 張曉曉 李瑩

摘要：通過單因素試驗從甘油、葡萄糖、凝膠、豐縣牛蒡粉、沛縣牛蒡粉中，選取葡萄糖、豐縣牛蒡粉、沛縣牛蒡粉作為副干酪乳桿菌FM-LP-4復(fù)合抗熱保護劑組分，然后采用正交設(shè)計對復(fù)合保護劑的組分進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，其最佳復(fù)合配方為豐縣牛蒡粉2.0%、葡萄糖4%、沛縣牛蒡粉2.0%，菌體經(jīng)75 ℃，10 min熱處理后活菌數(shù)為 6.33 lgCFU/mL。該結(jié)果可為牛蒡功能成分在提高益生菌熱耐受研究方面的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞：牛蒡;益生菌;抗熱保護劑;正交試驗;沛縣牛蒡粉

中圖分類號： R284.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）18-0211-03

收稿日期：2019-11-09

基金項目：江蘇省蘇北科技專項資金（編號：XZ-SZ201836）。

作者簡介：崔?莉（1978—），女，內(nèi)蒙古鄂爾多斯人，博士，副研究員，從事營養(yǎng)功能食品加工關(guān)鍵技術(shù)研究。E-mail：clisu1@163.com。

通信作者：李?瑩，博士，副研究員，主要從事食品營養(yǎng)與健康研究。E-mail：hijoly@163.com。

牛蒡亦稱山牛蒡，為菊科多年生草本植物。牛蒡根莖較長，為65～100 cm;皮色有淺黃、黑褐色2種;肉為灰白色，質(zhì)脆，稍粗硬，斷面呈淺黃色;內(nèi)皮層環(huán)紋明顯，氣香，味甘甜。牛蒡塊根富含菊糖、酚酸、黃酮、維生素A、維生素B、牛蒡苷、生物堿等營養(yǎng)功能成分?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，牛蒡具有健脾胃、清熱解毒、抗氧化、抑菌、抗疲勞、免疫調(diào)節(jié)、保護肝臟[1-3]、促進(jìn)益生菌生長等多種功效[4-6]。

20世紀(jì)80年代末，江蘇省豐縣率先引種牛蒡并栽培成功，現(xiàn)已成為全國最大的牛蒡生產(chǎn)基地，種植面積超過6 666.7 hm2，總產(chǎn)量高達(dá)1.6億kg。牛蒡已成為全國較有影響的特色蔬菜之一，目前牛蒡種植以豐縣為中心，不斷向全國擴展。抗熱保護劑的選擇和使用策略一直是工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)益生菌產(chǎn)品的熱點與難點。Chaikham等研究發(fā)現(xiàn)益生元（菊糖、木糖、低聚果糖等）對益生菌的耐熱性有保護作用[7]。Li等檢測發(fā)現(xiàn)牛蒡菊糖能夠顯著增強雙歧桿菌的活性[8]。本研究通過探索牛蒡全粉的益生菌耐熱保護作用，深入研究牛蒡的保健功效成分，以期為提高牛蒡附加值提供科技支撐。

1?材料與方法

試驗于2019年7月12日至2019年8月17日在江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所進(jìn)行。

1.1?試驗材料

試驗材料：副干酪乳桿菌FM-LP-4，江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所食品生物工程研究室保藏。蔗糖、甘油、明膠均為食品級。

用0.067 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（pH值6.98）將明膠溶解，配制成所需濃度的溶液，于 114 ℃ 滅菌10 min，冷卻后于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。使用前?7 ℃水浴中預(yù)熱10 min。蔗糖、甘油使用無菌水配制成所需濃度的溶液，經(jīng)無菌微孔濾膜過濾（現(xiàn)用現(xiàn)制）。配制的保護劑溶液在確認(rèn)無菌后方可使用。MRS肉湯培養(yǎng)基（北京陸橋技術(shù)股份有限公司）：用于菌體擴大培養(yǎng)。MRS固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加入1.5%的瓊脂即可，用于菌落計數(shù)。

1.2?儀器與設(shè)備

SW-CJ-ID型凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司;YX280手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器，上海三申醫(yī)療器械有限公司;H1850R型高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司;XDW超微粉碎機，濟南達(dá)微機械有限公司;HYG-A全溫?fù)u瓶柜，太倉試驗設(shè)備廠;FW100高速萬能打粉機，天津市泰斯特儀器有限公司。

1.3?試驗方法

1.3.1?菌種活化及擴大培養(yǎng)?將副干酪乳桿菌 FM-LP-4菌種由MRS固體斜面培養(yǎng)基接入液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)24 h，反復(fù)活化2～3次。將活化好的純菌種以5%的接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃恒溫振蕩進(jìn)行擴大培養(yǎng)。擴大培養(yǎng)的菌液于10 ℃，6 000 r/min離心15 min，棄上清液，用無菌生理鹽水沖洗沉淀，制成活菌數(shù)為 9 lg CFU/mL 的菌懸液。

1.3.2?活菌數(shù)測定?按照GB 4789.35—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)?食品微生物學(xué)檢驗?乳酸菌檢驗》，采用稀釋涂布平板計數(shù)法，每個樣品選取3個稀釋梯度，每個梯度做3個平行試驗，求取平均值。

1.3.3?牛蒡超微粉的制備?牛蒡片干燥溫度選擇：稱量新鮮牛蒡片，每份10 g，分別放置在50、60、70、80 ℃等4個溫度，放置不同時間測量其水分含量，平行測定3次。牛蒡超微粉的制備：將牛蒡放于篩選得到的干燥溫度和時間下，直至含水量在6%以下，經(jīng)超微粉碎機粉碎，過325目篩得牛蒡超微粉。

1.3.4?抗熱保護劑篩選?將菌懸液加入含不同保護劑的MRS液體培養(yǎng)基中，于75 ℃恒溫水浴中保溫10 min。測定保溫前后活菌數(shù)，并計算存活率。保護劑的濃度如表1所示。試驗結(jié)果采用SPSS 130統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，以篩選出相應(yīng)溫度下的最佳乳酸菌抗熱保護劑及配比。

1.3.5?復(fù)合保護劑對菌體抗熱性的影響?根據(jù)單因素試驗結(jié)果，以乳酸菌活菌數(shù)為考察指標(biāo)，采用正交試驗L9（34）對豐縣牛蒡粉（A）、葡萄糖（B）、沛縣牛蒡粉（C）等3種不同抗熱保護劑進(jìn)行考察，因素水平表見表2。試驗結(jié)果采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，以篩選出相應(yīng)溫度下的最佳乳酸菌抗熱保護劑及配比。

2?結(jié)果與分析

2.1?牛蒡片最優(yōu)干燥時間和溫度的確定

由表3可知，將牛蒡片經(jīng)50、60、70、80 ℃溫度干燥后，達(dá)到水分含量在6%以下的時間分別為6、4、3、3 h。牛蒡片在70、80 ℃溫度下干燥所需時間雖短，只要3 h，但是牛蒡片出現(xiàn)外部焦糊而內(nèi)部未完全干燥的現(xiàn)象比較嚴(yán)重，因此選擇60 ℃、4 h為適宜的干燥溫度和時間。

2.2?單一保護劑對菌體抗熱性的影響

加入不同保護劑于75 ℃保溫10 min后，菌體存活率見表4。由表4可以看出，加入保護劑經(jīng)熱處理過的菌體均呈現(xiàn)出一定的存活率。5種保護劑中，豐縣牛蒡粉的保護效果最好，菌體經(jīng)熱處理后存活菌數(shù)最高，為5.91 lg CFU/mL，其他保護劑的保護效果降序排列為沛縣牛蒡粉、葡萄糖、明膠、甘油。效果較好的3種保護劑的最適使用濃度分別為豐縣牛蒡粉1.5%，沛縣牛蒡粉1.5%，葡萄糖6%。

其中，使用2種牛蒡粉的存活菌數(shù)量隨著保護劑濃度的增大而逐漸提高，但使用濃度大于1.5%后，菌體存活率開始下降;而使用葡萄糖、明膠、甘油的存活菌數(shù)量，都呈現(xiàn)出隨保護劑用量的增加而先上升后下降的趨勢。Li等采用葡萄糖作為冷凍干燥保護劑，在添加濃度為2.0%、4.0%、8.0%時，益生菌LactobacilluscaseiZhang 的活菌數(shù)從初始的8.02 lg CFU/mL分別下降到2.01、2.87、3.20 lg CFU/mL，確定8.0%為適宜的菌體保護劑濃度[9]。程艷薇等得出干酪乳桿菌高溫馴化抗熱保護劑的最佳配比是明膠1.5 g/dL、蔗糖6 g/dL、甘油3 mL/dL，50 ℃生長良好，菌活量可以達(dá)到要求，能達(dá)到實際生產(chǎn)中所需的菌量[10]。陳合等經(jīng)優(yōu)化確定了干酪乳桿菌L61抗熱保護劑的組成及最適添加量為脫脂乳 18 g/L、葡萄糖6%、甘油13 mL/L，在75 ℃，10 min下存活率可達(dá)到8.46%[11]。曾海英等研究發(fā)現(xiàn)添加3%甘油、6%蔗糖、2%明膠作抗熱保護劑，可提高植物乳桿菌1L-2的高溫存活率，55 ℃培養(yǎng)，活菌數(shù)可達(dá)2.2×108 CFU/mL[12]。范娜等研究表明，海藻糖、明膠、甘油均能夠提高菌體的抗熱存活率，3種保護劑之間存在交互作用，其最佳復(fù)合配方為海藻糖16%、甘油6%、明膠0.14%，75 ℃ 保溫30 min，菌體存活率可達(dá)16.58%，活菌數(shù)為1.66×108 CFU/mL[13]。

2.3?復(fù)合保護劑對菌體抗熱性的影響

抗熱保護劑配比L9（34）正交試驗因素水平及結(jié)果見表5。直觀比較3個因素的極差（R）大小，可知各因素對熱處理后菌存活的影響程度表現(xiàn)為A>C>B。由活菌數(shù)大小可知，最佳組合為A3B1C3，即抗熱保護劑的最佳配比為在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加20%豐縣牛蒡粉、4%葡萄糖、2.0% 沛縣牛蒡粉。

3?結(jié)論

經(jīng)優(yōu)化篩選獲得副干酪乳桿菌FM-LP-4復(fù)合抗熱保護劑組分為豐縣牛蒡粉2.0%、葡萄糖4%、沛縣牛蒡粉2.0%，經(jīng)75 ℃，10 min熱處理后活菌數(shù)為6.33 lg CFU/mL。

本研究發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地牛蒡粉的抗熱效果不同，并得出針對FM-LP-4的復(fù)合抗熱保護劑組成配比，為益生菌抗熱保護劑的制備提供了新思路，為牛蒡功能成分在提高益生菌熱耐受研究方面的應(yīng)用提供了數(shù)據(jù)支持。

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