鴿新城疫滅活疫苗效力評(píng)價(jià)中實(shí)驗(yàn)鴿的篩選

劉云迎 刁小龍 陳堅(jiān) 屠頡 何海蓉

摘要：為解決鴿新城疫滅活疫苗免疫效力評(píng)價(jià)中的標(biāo)準(zhǔn)鴿缺失問(wèn)題，篩選滿足要求的試驗(yàn)鴿。2019年3月對(duì)鴿場(chǎng)飼養(yǎng)管理和鴿群發(fā)病史情況進(jìn)行調(diào)研，篩選合格鴿場(chǎng);采血進(jìn)行鴿新城疫抗體檢測(cè)，排除高母源抗體鴿群;進(jìn)一步檢測(cè)鴿圓環(huán)、鴿腺病毒和鴿痘，排除感染上述易感病原鴿群;最后對(duì)選定的鴿隔離飼養(yǎng)一定時(shí)間，排除潛在的病原感染;采用篩選鴿進(jìn)行鴿新城疫滅活苗免疫攻毒試驗(yàn)，驗(yàn)證是否滿足試驗(yàn)的需求。通過(guò)調(diào)研，確定3家鴿場(chǎng)，從1月齡左右鴿群中隨機(jī)選擇50羽健康鴿進(jìn)行檢測(cè)，ND母源抗體為0～1 ∶32不等，均無(wú)鴿腺病毒感染，但有個(gè)別鴿存在圓環(huán)抗體或攜帶鴿痘病毒。從其中2家鴿場(chǎng)購(gòu)回HI抗體≤1 ∶4，且無(wú)其他病原感染風(fēng)險(xiǎn)的鴿各25羽進(jìn)行鴿新城疫滅活疫苗免疫攻毒試驗(yàn)，血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示，免疫組鴿免后28 d ND HI抗體在1 ∶16～1 ∶64之間，均值在1 ∶32以上;攻毒保護(hù)結(jié)果為，免疫組17/20～19/20保護(hù)，對(duì)照組均5/5發(fā)病，3～4羽死亡。通過(guò)鴿場(chǎng)調(diào)研初篩、新城疫HI抗體檢測(cè)、鴿常見(jiàn)病原檢測(cè)、隔離觀察等步驟篩選的實(shí)驗(yàn)鴿可滿足鴿新城疫滅活疫苗效力評(píng)價(jià)試驗(yàn)的要求，且結(jié)果穩(wěn)定可靠。通過(guò)該研究篩選的實(shí)驗(yàn)鴿，滿足試驗(yàn)需求、提高研究結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，并在保證鴿用疫苗質(zhì)量方面具有重要意義。

關(guān)鍵詞：鴿新城疫滅活苗;效力評(píng)估;實(shí)驗(yàn)鴿;篩選研究

中圖分類號(hào)： S858.91文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）18-0177-04

收稿日期：2019-11-08

基金項(xiàng)目：江蘇省泰州市科技支撐計(jì)劃（農(nóng)業(yè)）項(xiàng)目（編號(hào)：SNY20190069）。

作者簡(jiǎn)介：劉云迎（1988—），女，山東濱州人，碩士，獸醫(yī)師，主要從事新獸藥研發(fā)與應(yīng)用研究。E-mail：liuyunying@xnswkj.cn。

通信作者：何海蓉，博士，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事禽病診斷、疫苗研發(fā)與評(píng)價(jià)研究。E-mail：hehairong@xnswkj.cn。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是生物制品研發(fā)、生產(chǎn)和檢驗(yàn)的重要原材料之一，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的品質(zhì)直接影響動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果。我國(guó)是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)和使用大國(guó)，但我國(guó)自主培育的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種質(zhì)資源很少，標(biāo)準(zhǔn)化與社會(huì)化程度低。目前，國(guó)際上公認(rèn)的陸禽類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，只有無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）雞，其他禽類如鴨、鴿、鵝等既無(wú)標(biāo)準(zhǔn)也無(wú)級(jí)別，因標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)動(dòng)物的缺失，嚴(yán)重限制了相關(guān)預(yù)防及治療性產(chǎn)品的開發(fā)。

近幾年，隨著我國(guó)養(yǎng)鴿業(yè)的迅速發(fā)展，對(duì)鴿疾病的研究越來(lái)越多。鴿Ⅰ型副黏病毒?。≒igeon Paramyxovirus Ⅰ，PPMV-Ⅰ）俗稱鴿瘟，又稱鴿新城疫，是由鴿Ⅰ型副黏病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。各種品種、日齡鴿均可感染。該病流行期長(zhǎng)，具有發(fā)病快、發(fā)病率和死亡率高的特點(diǎn)。病死率為30%～80%，嚴(yán)重時(shí)死亡率可達(dá)95%以上。近年來(lái)鴿新城疫流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國(guó)鴿群中流行的鴿新城疫病病毒均以基因Ⅵb亞型為主。目前，市場(chǎng)上的新城疫疫苗主要為防控雞新城疫而開發(fā)，其與基因Ⅵb亞型的鴿新城疫病病毒遺傳距離較遠(yuǎn)，且存在明顯的抗原差異性，因此經(jīng)常出現(xiàn)免疫過(guò)的鴿場(chǎng)散發(fā)鴿新城疫的現(xiàn)象。為此，筆者所在課題組研究開發(fā)了Ⅵb亞型鴿新城疫滅活疫苗。研究早期在開展動(dòng)物試驗(yàn)時(shí)，因無(wú)標(biāo)準(zhǔn)SPF級(jí)鴿，普通鴿個(gè)體差異較大，得出的試驗(yàn)數(shù)據(jù)存在偏差。因此筆者所在課題組建立了試驗(yàn)鴿的篩選方法。本研究篩選的實(shí)驗(yàn)鴿不僅可滿足鴿新城疫滅活疫苗效力評(píng)價(jià)試驗(yàn)的要求，同時(shí)能夠提高相關(guān)研究結(jié)果的可靠性和重復(fù)性，保證鴿用疫苗產(chǎn)品的質(zhì)量。

1?材料與方法

1.1?試驗(yàn)材料

1.1.1?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物?白羽王鴿，購(gòu)自江陰、如皋和高港3地某鴿場(chǎng)。

1.1.2?主要試劑?Ⅵb亞型鴿新城疫滅活疫苗、雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)抗原、鴿新城疫陽(yáng)性血清、陰性血清和血凝抑制試驗(yàn)抗原、鴿腺病毒檢測(cè)試劑盒和鴿痘檢測(cè)試劑盒，均由筆者所在實(shí)驗(yàn)室制備;檢驗(yàn)用毒鴿副黏病毒Pi/NT/2011株，由揚(yáng)州大學(xué)分離、保存;雞新城疫標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所;鴿圓環(huán)檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.1.3?試驗(yàn)地點(diǎn)?抗體及病原檢測(cè)在中崇信諾生物科技泰州有限公司研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，動(dòng)物試驗(yàn)在中崇信諾生物科技泰州有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房進(jìn)行。

1.2?方法

1.2.1?實(shí)驗(yàn)鴿的篩選

1.2.1.1?初篩?對(duì)江陰鴿場(chǎng)、如皋鴿場(chǎng)及高港鴿場(chǎng)進(jìn)行調(diào)研，實(shí)地查看鴿場(chǎng)飼養(yǎng)管理?xiàng)l件，同時(shí)詢問(wèn)鴿場(chǎng)發(fā)病史、疫苗免疫史及獸藥使用情況。觀察鴿群精神狀態(tài)、采食、飲水、糞便及生長(zhǎng)發(fā)育等是否正常。

1.2.1.2?抗體檢測(cè)?從符合初篩條件的鴿群中隨機(jī)抽取50羽1月齡左右的鴿，編號(hào)并采血，分離血清。因目前鴿場(chǎng)一般采用雞新城疫疫苗來(lái)預(yù)防鴿副黏感染，故采用雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)抗原測(cè)定HI抗體效價(jià)，檢測(cè)每只鴿的母源抗體水平。

1.2.1.3?易感病原的檢測(cè)?將采集的血樣按照鴿圓環(huán)病毒抗體（CV-Ab）ELISA檢測(cè)試劑盒、鴿腺病毒PCR檢測(cè)試劑盒和鴿痘病毒PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。剔除檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性或可疑者。

1.2.1.4?隔離觀察?篩選合格的鴿購(gòu)回，隔離飼養(yǎng)至少1周，隔離期間每日觀察鴿精神、采食、飲水、糞便及生長(zhǎng)發(fā)育情況。

1.2.2?鴿新城疫滅活疫苗效力試驗(yàn)?取篩選的鴿25羽，20羽各胸部肌肉注射滅活疫苗0.2 mL，另5羽不免疫作為對(duì)照。接種后28日，連同對(duì)照鴿分別采血分離血清，用鴿新城疫血凝抑制試驗(yàn)抗原測(cè)定HI抗體效價(jià)，同時(shí)胸部肌肉注射鴿副黏病毒Pi/NT/2011株，每羽0.2 mL（含106EID50，EID50指雞胚半數(shù)感染量）。觀察14 d，記錄各免疫組和對(duì)照組發(fā)病死亡情況。

2?結(jié)果與分析

2.1?陰性鴿的篩選情況

2.1.1?鴿場(chǎng)調(diào)研情況?經(jīng)調(diào)研，江陰、如皋及高港鴿場(chǎng)的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件較好，近2年內(nèi)均未發(fā)生過(guò)細(xì)菌、病毒、寄生蟲感染，它們的種鴿在近半年內(nèi)均未接種過(guò)疫苗。

2.1.2?新城疫抗體檢測(cè)結(jié)果?經(jīng)檢測(cè)，鴿群ND母源抗體為0～1 ∶32不等，3家鴿場(chǎng)HI抗體≤1 ∶4的鴿分別占比66%、48%和58%。檢測(cè)結(jié)果顯示，在父母代鴿同一時(shí)間免疫且產(chǎn)蛋時(shí)間相同的情況下，所產(chǎn)雛鴿的母源抗體水平仍有較大差異。不同鴿場(chǎng)鴿母源抗體檢測(cè)情況見(jiàn)表1、圖1。

2.1.3?易感病原的檢測(cè)結(jié)果?按照鴿圓環(huán)病毒抗體（CV-Ab）ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書、鴿腺病毒PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書和鴿痘病毒PCR檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書對(duì)采集的血樣進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，3家鴿場(chǎng)均無(wú)鴿腺病毒感染，個(gè)別鴿存在鴿圓環(huán)抗體或鴿痘病毒，提示可能存在鴿圓環(huán)病毒或鴿痘病毒感染。檢測(cè)結(jié)果詳見(jiàn)表2。

2.1.4?隔離觀察?從江陰鴿場(chǎng)和高港鴿場(chǎng)各購(gòu)回25羽HI抗體≤1 ∶4，且無(wú)其他易感病原感染的鴿，隔離觀察1周。鴿精神、采食、飲水、糞便均正常。

2.2?鴿新城疫滅活疫苗效力試驗(yàn)結(jié)果

用篩選的不同來(lái)源鴿同時(shí)進(jìn)行鴿新城疫滅活疫苗免疫攻毒試驗(yàn)。結(jié)果顯示，免疫后28 d，免疫組各鴿新城疫HI抗體在1 ∶16～1 ∶64之間，免疫組均值在1 ∶32以上;攻毒后二免疫組各有1羽和3羽鴿出現(xiàn)拉稀、翅膀下垂等癥狀，其余免疫鴿精神、采食、飲水、糞便均正常，無(wú)拉稀、翅膀下垂、癱瘓等神經(jīng)癥狀，17/20～19/20保護(hù)。對(duì)照組攻毒后全部發(fā)病，主要表現(xiàn)在羽毛蓬亂、縮頸、呆立不動(dòng)、嗜睡、單側(cè)或雙側(cè)翅膀下垂、個(gè)別癱瘓、頭頸扭曲、拉黃綠色稀糞、食欲不振、個(gè)別呼吸困難。攻毒后14 d內(nèi)各組3～4羽死亡。剖檢肌胃內(nèi)容物呈墨綠色，腺胃黏膜、腸道黏膜出血。免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

3?結(jié)論與討論

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是生命科學(xué)領(lǐng)域研究的重要支撐條件，世界上生物醫(yī)學(xué)研究論文有50%以上是通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)。在獸用生物制品領(lǐng)域，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量直接關(guān)系到獸用生物制品的產(chǎn)品質(zhì)量和生物安全性。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是一種“活的試劑和度量容器”，研發(fā)課題的確立，成果水平的高低均取決于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量[1]?，F(xiàn)行《中國(guó)獸藥典》附錄3501中對(duì)生產(chǎn)、檢驗(yàn)用動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了明確規(guī)定，但未見(jiàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)鴿的標(biāo)準(zhǔn)和要求。近年來(lái)，我國(guó)養(yǎng)鴿業(yè)發(fā)展迅速，規(guī)?；B(yǎng)殖企業(yè)不斷增多，養(yǎng)鴿業(yè)已經(jīng)成為繼雞、鴨、鵝之后的第四大禽類養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)，位居特禽養(yǎng)殖之首[2]。隨著養(yǎng)鴿業(yè)的發(fā)展，對(duì)鴿的養(yǎng)殖及疾病的研究越來(lái)越多。鴿新城疫是影響?zhàn)B鴿業(yè)發(fā)展的重要威脅之一。近幾年的流行病學(xué)調(diào)查顯示，當(dāng)前鴿群中新城疫流行株為Ⅵb亞型禽Ⅰ型副黏病毒，與雞群中主要流行株的基因型不一致[3-5]，試驗(yàn)也證明鴿新城疫與雞新城疫存在抗原差異性[6-7]，單純使用雞新城疫疫苗不能較好地保護(hù)鴿群免受當(dāng)前鴿新城疫流行株侵襲[8]。因此，研制與當(dāng)前鴿群流行株基因型一致的疫苗非常重要。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)鴿源新城疫病毒的研究主要集中在分離、鑒定、檢測(cè)方法及診斷試劑盒的研發(fā)，對(duì)疫苗的研制還較少，未見(jiàn)相關(guān)臨床批件或Ⅵb亞型鴿源新城疫疫苗注冊(cè)上市。為此，筆者所在課題組以Ⅵb亞型流行株為親本，利用反向遺傳技術(shù)及平臺(tái)成功構(gòu)建出首個(gè)Ⅵb亞型鴿新城疫病毒致弱株，開發(fā)出鴿專用的新城疫滅活疫苗。在毒種研究、生產(chǎn)工藝研究及疫苗質(zhì)量研究過(guò)程中，許多試驗(yàn)數(shù)據(jù)均需要標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)完成，但目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)SPF級(jí)鴿或標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物鴿。

筆者所在實(shí)驗(yàn)室在鴿新城疫滅活疫苗的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，鴿的品種、日齡、機(jī)體狀況、飼養(yǎng)環(huán)境等對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有很大影響。為了減少動(dòng)物模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，筆者所在課題組盡可能地選擇同一來(lái)源的非免鴿進(jìn)行試驗(yàn)。但因所需試驗(yàn)鴿數(shù)量較多，小規(guī)模鴿場(chǎng)難以滿足需求，大規(guī)模鴿場(chǎng)的鴿母源抗體水平太高。而且在試驗(yàn)過(guò)程中，由于飼養(yǎng)條件或環(huán)境的改變，鴿攜帶的病原會(huì)暴發(fā)，導(dǎo)致鴿發(fā)病或死亡，影響試驗(yàn)結(jié)果，浪費(fèi)人力、物力、財(cái)力。在目前尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)鴿的情況下，為避免鴿體內(nèi)外所攜帶的特定病原及母源抗體干擾，保證試驗(yàn)結(jié)果的可重復(fù)性，筆者所在課題組基于試驗(yàn)的需要，針對(duì)鴿對(duì)各種病原的易感性，建立了滿足試驗(yàn)要求的實(shí)驗(yàn)鴿篩選方法。

通過(guò)對(duì)鴿場(chǎng)進(jìn)行調(diào)研，排除半年內(nèi)有寄生蟲、細(xì)菌或病毒感染的鴿場(chǎng)，選擇眼睛炯炯有神、警惕性高，且采食、飲水、糞便及生長(zhǎng)發(fā)育等正常的鴿群作為候選鴿群。然后從1月齡鴿群中各隨機(jī)選擇50羽鴿編號(hào)、采血并分離血清，檢測(cè)新城疫母源抗體情況，排除新城疫HI抗體高于1 ∶4的鴿子。從檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，幼鴿新城疫母源抗體水平參差不齊，HI抗體在0～1 ∶32不等，≤1 ∶4的鴿占比50%左右，這與單達(dá)聰?shù)鹊难芯拷Y(jié)果[9]一致。同時(shí)對(duì)血樣分別進(jìn)行鴿圓環(huán)、鴿痘及鴿腺病毒的感染檢測(cè)，結(jié)果顯示3個(gè)鴿場(chǎng)均無(wú)鴿腺病毒感染，個(gè)別鴿存在鴿圓環(huán)抗體或攜帶鴿痘病毒，提示可能存在鴿圓環(huán)病毒或鴿痘病毒感染風(fēng)險(xiǎn)[10-12]。國(guó)內(nèi)外流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，由于鴿養(yǎng)殖的特殊性，鴿圓環(huán)感染在鴿群中普遍存在[13]。鴿感染圓環(huán)病毒后會(huì)導(dǎo)致免疫器官萎縮和淋巴細(xì)胞凋亡，抑制體液免疫和細(xì)胞免疫[14]，進(jìn)而影響疫苗的免疫效果。因此，筆者所在課題組將抗體檢測(cè)符合要求且無(wú)鴿圓環(huán)、鴿痘及鴿腺病毒感染的鴿購(gòu)回，隔離觀察1周，篩選精神、采食、飲水及糞便未見(jiàn)異常的鴿，用于鴿新城疫滅活疫苗效力試驗(yàn)的研究。疫苗免疫后28 d，免疫組鴿HI抗體水平均有增長(zhǎng)，且個(gè)體差異小。免后28 d攻毒，對(duì)照組均5/5發(fā)病，3/5～4/5死亡，試驗(yàn)成立;免疫組17/20～19/20保護(hù)，均達(dá)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明經(jīng)初篩、新城疫抗體監(jiān)測(cè)、易感病原排查、隔離飼養(yǎng)1周后篩選的健康鴿可滿足鴿新城疫滅活疫苗效力評(píng)價(jià)試驗(yàn)的要求，能夠真實(shí)反映疫苗的免疫效果。因此，在目前無(wú)SPF級(jí)或標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)鴿的情況下，通過(guò)本研究對(duì)鴿進(jìn)行的篩選，能夠獲得滿足實(shí)驗(yàn)需求的靶動(dòng)物，減少因靶動(dòng)物差異對(duì)試驗(yàn)結(jié)果造成的不良影響，另本研究可為SPF級(jí)鴿的培育和篩選奠定基礎(chǔ)。

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