重組菌絲霉素在畢赤酵母中的分泌表達及活性研究

鄧贛奇 陳柏東 黃增穎 宮莉 張輝華 劉燊

摘要：為獲得一種能分泌菌絲霉素的畢赤酵母菌并探討菌絲霉素的活性，將優(yōu)化的目的蛋白堿基序列與標簽MBP基因序列融合，通過雙酶切將重組基因序列插入到畢赤酵母pGAPZaA表達載體上并進行連接反應。取10 μL連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞，挑取含Zeocin（25 mg/L）平板篩選出的單菌落進行PCR鑒定，將陽性克隆送往測序公司測序。對鑒定正確的含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5α進行活化培養(yǎng)并提取其質(zhì)粒，得到的重組質(zhì)粒進一步線性化和純化，并電轉(zhuǎn)入GS115感受態(tài)細胞中篩選出陽性克隆，誘導分泌蛋白，對其進行Western blot檢測、純化、活性分析和質(zhì)譜鑒定，得到的重組蛋白為55 Ku左右，濃度為700 mg/L，純度達到80%以上。質(zhì)譜鑒定結(jié)果表明，蛋白序列的覆蓋率達到98%，純化后的蛋白也對金黃色葡萄球菌具有抑制作用，成功構(gòu)建出一株能夠分泌菌絲霉素的畢赤酵母菌，這為菌絲霉素的工業(yè)化生產(chǎn)和研發(fā)新型綠色的飼料添加劑奠定了基礎。

關鍵詞：菌絲霉素;畢赤酵母;重組蛋白;飼料添加劑

中圖分類號：S182;S816.7?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）18-0086-06

收稿日期：2019-11-03

基金項目：佛山市生物活性肽工程技術(shù)研究中心項目（編號：2017GA00022）;廣東省教育廳高?？蒲许椖浚ň幪枺?017GCZX006）。

作者簡介：鄧贛奇（1995—），男，江西贛州人，碩士研究生，從事動物營養(yǎng)研究。E-mail：dengganqi@foxmail.com。

通信作者：劉?燊，博士，副教授，主要從事動物生物技術(shù)與動物營養(yǎng)研究。E-mail：shencn@aliyun.com。

抗生素自被發(fā)現(xiàn)以來，為人類社會做出了極大貢獻，它不僅拯救了無數(shù)人的生命，更使畜牧生產(chǎn)得到了極大的提高。但隨著抗生素的大量使用和濫用，抗生素在畜禽體內(nèi)大量殘留，威脅著食品安全并影響生態(tài)環(huán)境，這使得細菌產(chǎn)生耐藥性而出現(xiàn)“超級細菌”。在歐洲的一些國家如瑞典，在1986年禁止向飼料中添加抗生素[1]，而為響應國家綠色發(fā)展的理念，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸醫(yī)局局長馮忠武在2018年的中國飼料發(fā)展論壇上表示，藥物飼料添加劑將在2020年全部退出[2]，“減抗”“替抗”因此成為了非常熱的研究方向，目前研究人員新研制出許多“減抗”“替抗”的產(chǎn)品，如微生態(tài)制劑、酶制劑、酸化劑、中草藥制劑、抗菌肽等?？咕淖鳛榫G色、高效、低毒、廣譜的飼料添加劑，是現(xiàn)在比較熱門的研究對象之一。

抗菌肽是生物體在抵抗病原菌時產(chǎn)生的一種防御性小肽，是組成免疫系統(tǒng)的重要組成成分，它對真菌、病毒、腫瘤等均有抑制作用，抗菌譜廣、分子量小、不易產(chǎn)生耐藥性、熱穩(wěn)定性和水溶性好，是目前替代抗生素較為理想的抗菌劑之一[3]。菌絲霉素是Mygind等從腐生子囊菌的分泌蛋白中分離得到，它是首次發(fā)現(xiàn)的真菌防御素，對人體不會產(chǎn)生危害[4]。Schneider等研究表明，菌絲霉素的作用機制主要是通過阻斷細胞壁的合成而起到殺菌的作用[5]。有研究表明，菌絲霉素對革蘭氏陽性菌有較強的抑制能力，沒有溶血性作用，可以用來治療感染革蘭氏陽性菌的疾病，可替代部分的抗生素類藥物[6-7]。傳統(tǒng)獲得菌絲霉素的方法是從天然微生物中分離提取，但這種方法分離純化工序復雜、成本高、產(chǎn)量低，限制了其廣泛的應用。

近年來，得益于基因工程的大力發(fā)展，通過構(gòu)建高效的蛋白表達系統(tǒng)即可獲得更多的菌絲霉素。根據(jù)萬津的研究，將Ple多聚體基因克隆到畢赤酵母分泌型表達載體pPICZaA，轉(zhuǎn)化后得到1株基因工程菌PPle，通過搖瓶誘導，畢赤酵母基因工程菌PPle分泌水平達143 mg/L[8]。李洪金等探討重組NZ2114畢赤酵母工程菌的高效發(fā)酵工藝，并從培養(yǎng)基配方、接種條件、甲醇誘導、流加方式、菌體濕重等幾個方面入手，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用BSM培養(yǎng)基，接種量為15%，甲醇誘導48 h，濕重達到3×105 mg/L時，菌絲霉素的表達量是最高的且活性達到最佳狀態(tài)，此時的成本也控制在可接受范圍內(nèi)[9]。李延的重組菌絲霉素發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化試驗表明，甘油基礎鹽培養(yǎng)基為最適發(fā)酵培養(yǎng)基，在發(fā)酵114 h時，上清液的總蛋白濃度可達3 941 mg/L[10]。

本試驗通過重組菌絲霉素基因序列，將其克隆到畢赤酵母表達載體pGAPZaA中，構(gòu)建出一種胞內(nèi)表達菌絲霉素的畢赤酵母菌，再通過適當?shù)陌l(fā)酵條件，分離純化獲得菌絲霉素，為其工業(yè)化生產(chǎn)以及重組菌絲霉素作為飼料添加劑的開發(fā)利用奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?試驗菌種與質(zhì)粒

畢赤酵母GS115菌用于重組載體的表達;pMAL-c5x質(zhì)粒（10 ng/μL）用于擴增編碼融合標簽MBP的基因序列;DH5α感受態(tài)細胞;pGAPZaA載體。

1.2?試驗試劑

試驗主要試劑有UltraPureTM DNase/RNase-Free Distilled Water（10977015，Invitrogen）、2×Hotstart Taq PCR ProMix、2×PfuMax HiFi PCR ProMix，均購自廣州英贊生物科技有限公司;凝膠純化試劑盒、DNA純化試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，均購自天根生化科技有限公司;10×FD buffer、10×T4 ligase buffer、10×Cutsmart Buffer、Buffer A[50 mmol/L三甲醇氨基甲烷（pH值8.0）、50 mmol/L 氯化鈉、5%甘油]、洗脫緩沖液Buffer B[50 mmol/L三甲醇氨基甲烷（pH值8.0）、50 mmol/L氯化鈉、500 mmol/L咪唑、5%甘油];Low Salt LB（不含抗生素）培養(yǎng)液;抗生素Zeocin;T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶（AvrⅡ、EcoRⅠ和XbaⅠ）、DNA marker、蛋白質(zhì)marker，均購自大連TaKaRa公司;YPDS培養(yǎng)基（10.0 g/L酵母提取物、20.0 g/L蛋白胨、20.0 g/L葡萄糖、1.0 mol/L山梨醇）;LDST溶液[100 mmol/L LiAc，10 mmol/L dithiothreitol，0.6 mol/L sorbitol，10 mmol/L Tris-HCl（pH值75），現(xiàn)用現(xiàn)配不能保存];考馬斯亮藍G-250;其他試劑均為進口或國產(chǎn)分析純。

1.4.6?重組菌絲霉素在畢赤酵母中的表達檢測和濃度的測定?在30 ℃、250 r/min條件下分別培養(yǎng)0、6、12、24、48、72、96 h，用15 mL離心管取6 mL培養(yǎng)液，于8 000 r/min離心5 min，上清轉(zhuǎn)至另一個 15 mL 離心管，不同表達時間的培養(yǎng)液上清經(jīng)超濾濃縮、硫酸銨沉淀并復溶后進行Western blot檢測。考馬斯亮藍與芳香族氨基酸在酸性介質(zhì)中結(jié)合后，溶液變成藍色，溶液的最大吸收峰從465 nm轉(zhuǎn)成595 nm，因為顏色的變化程度與蛋白濃度呈正比，所以再檢測595 nm處溶液中蛋白質(zhì)濃度的吸光度，即可進一步得其濃度，所得重組菌絲霉素蛋白的濃度為 700 mg/L，用50 mmol/L三甲醇氨基甲烷（pH值80）、50 mmol/L氯化鈉和5%甘油的緩沖液將其儲存。

1.4.7?重組菌絲霉素蛋白的質(zhì)譜鑒定?將純化所得重組菌絲霉素蛋白液加入0.05 mol/L TCEP溶液，60 ℃反應1 h，還原完后，加入 55 mmol/L MMTS溶液，并在室溫下避光45 min;然后將菌絲霉素蛋白液加入10 Ku超濾管中，12 000 g下離心20 min，后加入100 μL UA（8 mol/L urea，pH值8.5）溶液，12 000 g 離心20 min，并離心2次，將 100 μL 0.25 mol/L TEAB加入到超濾管中，12 000 g離心20 min，重復3次;繼續(xù)加入50 μL 0.5 mol/L TEAB溶液和2%胰酶（胰酶與蛋白質(zhì)量比為1 ∶50），在37 ℃下孵育12 h。次日補加1%胰酶（胰酶與蛋白質(zhì)量比為1 ∶100），并在37 ℃孵育4 h，離心收集濾液，低溫真空抽干。

所得樣品用0.1%甲酸、2%乙腈混合液進行溶解，在13 200 r/min，4 ℃條件下離心20 min，取上清，進行質(zhì)譜鑒定;做完質(zhì)譜后，還需將質(zhì)譜原始文件經(jīng)過MM File Conversion軟件處理轉(zhuǎn)換，然后將所得到的數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫進行比對分析。

1.4.8?重組菌絲霉素蛋白體外抑菌活性的測定?將保存在-20 ℃的大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌菌液劃板活化，直至長出單菌落為止，挑取單菌落于LB液體培養(yǎng)基中，孵化培養(yǎng)12 h，用3個錐形瓶分別配制100 mL LB固體培養(yǎng)基，在滅完菌冷卻至45 ℃時，分別吸取100 μL菌液加入到培養(yǎng)基中并輕輕搖均勻倒板，待板干燥后擺放好牛津杯，將提純得到的重組菌絲霉素蛋白（700 mg/L）稀釋10倍、100倍，吸取200 μL分別加入牛津杯中，空白對照則加無菌水，并做3個重復，然后放入 37 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，用電子游標卡尺測量抑菌圈的大小。

2?結(jié)果與分析

2.1?重組基因的驗證

在完成標簽MBP基因序列的PCR擴增編碼融合，合成重組有MBP標簽的目的蛋白基因序列后，分別取PCR產(chǎn)物進行1.0%瓊脂糖電泳分析，結(jié)果（圖1、圖2）表明，擴增大小與理論預測相符合。

2.2?pGAPZaA-MBP表達載體的驗證

挑取12個“1.4.5”節(jié)中平板上的單菌落，分別溶到500 μL含25 μg/mL Zeocin的Low Salt LB培養(yǎng)液中，37 ℃、180 rpm/min振蕩培養(yǎng)4 h，每管取 0.5 μL 菌液作模板進行PCR，后取5 μL PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖電泳分析，用載體上游和下游引

物擴增的條帶理論大小為1 300 bp左右，結(jié)果表明，實際擴增條帶為1 500 bp，符合合理的范圍內(nèi)，而除第8、9號外其他均為陽性克隆菌（圖3），為進一步鑒定，挑取10、11號菌進行測序，測得部分結(jié)果如圖4所示，其中小寫部分為N端融合標簽MBP蛋白的部分基因序列，標記下劃線部分為目的蛋白的基因序列即菌絲霉素的基因序列，標記方框部分為C端融合標簽的基因序列，測序結(jié)果表明MBP基因克隆正確，成功構(gòu)建了重組表達載體pGAPZaA-MBP。

2.3?重組菌絲霉素蛋白的純化及在畢赤酵母中的表達檢測

純化后的重組菌絲霉素蛋白進行SDS-PAGE電泳，由圖5可見，蛋白純化后純度在80%以上。將不同時間的培養(yǎng)液上清經(jīng)超濾濃縮、硫酸銨沉淀并復溶后進行Western blot檢測，由圖6可知，帶組氨酸標簽的目的蛋白獲得了可溶性表達，并且在 48 h 培養(yǎng)后目的蛋白的表達量趨于飽和，因此表達培養(yǎng)時間為48 h較好。

2.4?重組菌絲霉素蛋白的質(zhì)譜鑒定

根據(jù)質(zhì)譜的鑒定分析可得重組菌絲霉素蛋白完整的氨基酸序列，如圖7所示，其中標記方框部分表示未匹配上的序列，其余部分均為匹配上的序列，將鑒定分析出的序列用MASCOT（V21，Matrix Science，London U.K）搜庫軟件進行比對可得蛋白序列的覆蓋率達98%，則可得該蛋白即為重組菌絲霉素蛋白。

2.5?重組菌絲霉素蛋白體外抑菌活性的研究

將重組菌絲霉素蛋白（700 mg/L）稀釋10、100倍后，測得其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和沙門氏菌抑制效果的數(shù)據(jù)，用軟件SPSS21進行數(shù)據(jù)分

析，結(jié)果（表1）表明，重組菌絲霉素對革蘭氏陽性菌如金黃色葡萄球菌有抑制效果，且重組菌絲霉素的濃度越高抑制效果就越好，而重組菌絲霉素對革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、沙門氏菌的抑制效果非常的微弱，這與Mygind等的研究結(jié)果[4，8]相同。

3?討論

防御素是機體第一道防線的組成成分，屬于β折疊型抗菌肽，廣泛存在于各種生物中，對真菌、細菌、病毒、腫瘤等均具有一定的抑制作用[11-12]。目前，制備防御素的途徑主要有天然提取、化學合成、基因工程表達，因前2種獲取方法提取工藝復雜、成本高等，基因工程表達則成為獲取大量外源蛋白的主要方法[13]。畢赤酵母因為具有較為完善的基因表達調(diào)控機制、蛋白質(zhì)加工修飾能力且不會產(chǎn)生內(nèi)毒素，所以廣泛用于產(chǎn)外源蛋白的表達系統(tǒng)[14-15]。

本試驗提供一種獲取多量重組菌絲霉素及其表達載體構(gòu)建的方法，即根據(jù)目標蛋白質(zhì)的氨基酸序列，對密碼子優(yōu)化并確定堿基序列，將含有MBP的基因序列與pGAPZaA表達載體相連接，并將重新組成的載體轉(zhuǎn)入到畢赤酵母細胞中，表達出所需要的菌絲霉素，對其進行純化得到濃度為 700 mg/L，并對金黃色葡萄球菌有一定的抑制效果。根據(jù)Zhang等研究，菌絲霉素類似物NZ2114對金黃色葡萄球菌具有較高的專一性，抗菌效果可達到與青霉素與萬古霉素相當甚至更優(yōu)[16]，則表明重組菌絲霉素都具有對金黃色葡萄球菌較強抑制效果的趨同性。

抗菌肽被認為是最具有發(fā)展前景的綠色飼料添加劑之一，與傳統(tǒng)抗生素相比，它具有無耐藥性和對人體無毒副作用，是抗生素理想的替代品之一[17]。近年來，一些抗菌肽產(chǎn)品已投入到市場上銷售，表明抗菌肽應用到飼料添加劑中正日漸變得廣泛，根據(jù)Ma等的研究，飼料中添加重組防御素可以顯著增加肉雞的平均日增質(zhì)量、降低料肉比，與空白對照組相比，血清免疫球蛋白M與免疫球蛋白G等含量都顯著增高，其脂肪酶與胰蛋白酶的活性也會增高[18]。根據(jù)李延等研究表明，在基礎日糧的基礎上添加0.2%重組菌絲霉素可以顯著提高斷奶仔豬的平均日采食和平均日增質(zhì)量，其回腸中食糜雙歧桿菌的數(shù)量也顯著增加[19];此外，菌絲霉素也具有治療奶牛金葡菌乳腺炎的潛力[20]。

根據(jù)這些研究結(jié)果可知，重組菌絲霉素作為飼料添加劑，對肉雞、仔豬等都具有較好的促生長效果，甚至可作為藥制劑來治療某些疾病。該研究為產(chǎn)多量的菌絲霉素提供了更加廉價的途徑，同時也為綠色新型飼料添加劑的利用和開發(fā)奠定了基礎。

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