豬乙型腦炎病毒SYBR-GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立

常晨 張道華 唐波 劉國(guó)陽(yáng) 華濤 王海燕

摘要：為建立豬乙型腦炎病毒（JEV）的定量檢測(cè)方法，根據(jù)E基因序列，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，建立檢測(cè)JEV的熒光定量PCR方法。結(jié)果顯示，該方法靈敏度達(dá)到103拷貝/μL，對(duì)豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV）均無(wú)交叉反應(yīng)，具有良好的特異性和重復(fù)性;采用JEV攻毒小鼠，熒光定量PCR比普通PCR更能靈敏地檢出組織帶毒量。該方法可用于組織樣品中乙腦病毒的定量檢測(cè)以及臨床乙腦病毒感染的早期檢測(cè)和定量分析豬乙腦病毒感染程度。

關(guān)鍵詞：豬乙腦病病毒;SYBR-GreenⅠ;熒光定量PCR;檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào)： S852.65文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2020）18-0081-05

收稿日期：2019-12-04

基金項(xiàng)目：國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2018YFD0500800）;公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（編號(hào)：201403051）;江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（17）3049]。

作者簡(jiǎn)介：常?晨（1987—），女，江蘇南京人，碩士，助理研究員，主要從事動(dòng)物疫苗產(chǎn)品研究工作。E-mail：346283525@qq.com。

通信作者：張道華，碩士，研究員，主要從事動(dòng)物分子病原學(xué)及免疫學(xué)研究。E-mail：zhangdh2005@163.com。

日本流行性乙型腦炎（乙腦，Japanese encephalitis，JE）是由乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的一種人畜共患傳染病。乙型腦炎病毒主要通過(guò)攜帶病毒的蚊蟲(chóng)叮咬傳播，庫(kù)蚊、伊蚊和按蚊是JEV的主要傳播媒介，豬是主要貯存宿主及擴(kuò)散宿主，JE主要發(fā)生于夏秋季節(jié)。豬乙腦病常引起妊娠母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎或弱胎，公豬睪丸炎，育肥豬持續(xù)高熱，新生仔豬神經(jīng)癥狀，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)安全生產(chǎn)帶來(lái)嚴(yán)重威脅[1-2]。對(duì)豬進(jìn)行疫苗免疫能有效減少JEV對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成的危害，進(jìn)行及時(shí)正確的診斷是預(yù)防和控制該病的關(guān)鍵[3]。

診斷豬乙型腦炎的病原學(xué)方法有病毒分離鑒定、RT-PCR檢測(cè)、熒光定量RT-PCR、熒光環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增（RT-LAMP）、基因芯片技術(shù)等[4]。孫靜等曾報(bào)道，采用RT-PCR方法檢測(cè)JEV，雖靈敏且能在疾病早期對(duì)病毒進(jìn)行檢測(cè)，但由于分析步驟繁瑣且容易造成污染，所以使用受到限制[5]。熒光定量RT-PCR方法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性好，熒光染料SYBR-GreenⅠ熒光信號(hào)的積累與擴(kuò)增的雙鏈DNA數(shù)量呈正相關(guān)，該方法成本較探針?lè)ǖ停铱蛇_(dá)到快速、定量的目的，對(duì)疾病的早發(fā)現(xiàn)、早預(yù)防起著重要的作用[6]。

JEV為單股正鏈RNA病毒，E基因是乙腦病毒毒力基因，E蛋白為該病毒的主要表面結(jié)構(gòu)蛋白，存在大量的中和抗原表位，是病毒重要的抗原決定簇[7]。本研究以E基因序列作為靶序列設(shè)計(jì)1對(duì)引物，利用SYBR-GreenⅠ熒光染料定量PCR方法，定量檢測(cè)組織中的病毒含量，對(duì)診斷乙腦早期感染和對(duì)病毒凈化有重要意義。

1?材料與方法

1.1?毒株與試驗(yàn)動(dòng)物

JEV J3株、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬細(xì)小病毒（PPV）、豬瘟病毒（CSFV）、豬偽狂犬病毒（PRV），由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離與保存;1周齡無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)BALB/c小鼠，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供。

1.2?主要試劑與儀器

RNA iso Reagent試劑盒、DL 2000 Marker、Ex TaqTM、SYBR Premix Ex TaqTM 、pMD18-T載體、凝膠回收試劑盒、載體連接試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DH5α感受態(tài)細(xì)胞，購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;Rotor-Gene 3000熒光定量PCR儀，購(gòu)自美國(guó)Gene公司。

1.3?引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)Gen Bank中JEV的E基因序列設(shè)計(jì)獲得重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品引物，即上游引物：5′-TTGGTCGCTCCGGCTTACAG-3′;下游引物：5′-GCCACTTCCACACCTCATCT-3′，目的片段大小為1 574 bp。設(shè)計(jì)獲得熒光定量PCR上下游引物，即上游引物：5′-AGAGCGGGGAAAAAGGTC-3′;下游引物：5′-TTTCACGCTCTTTCTACAGT-3′，目的片段大小為 162 bp。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.4?質(zhì)粒模板標(biāo)準(zhǔn)品的制備

提取JEV J3株病毒RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增獲得乙腦E基因片段，PCR運(yùn)行程序如下：94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 15 min，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段采用凝膠回收試劑盒回收，將回收產(chǎn)物連接至 pMD-18T載體上，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中。提取獲得重組質(zhì)粒后，進(jìn)行酶切鑒定。將酶切大小正確的重組質(zhì)粒送至上海英駿生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的陽(yáng)性質(zhì)粒作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，命名為pMD-JEV-E。

1.5?SYBR-GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)體系及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用紫外分光光度計(jì)測(cè)量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD-JEV-E的吸光度，并計(jì)算拷貝數(shù)，以10倍梯度稀釋質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得到動(dòng)力學(xué)曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。PCR擴(kuò)增體系為20 μL反應(yīng)體系，其中上、下游引物各0.4 μL（10 μmol/L），SYBR Premix Ex TaqTM 10.0 μL，模板2.0 μL，滅菌去離子水7.2 μL。反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為95 ℃ 5 min;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。

1.6?重復(fù)性檢驗(yàn)

選取乙腦病毒同一濃度的質(zhì)粒進(jìn)行SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)，每個(gè)樣品做3個(gè)重復(fù)，通過(guò)CT值和溶解曲線峰值溫度分析驗(yàn)證JEV SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法的重復(fù)性與穩(wěn)定性。

1.7?特異性檢驗(yàn)

提取JEV、CSFV病毒液總RNA，再反轉(zhuǎn)錄為cDNA。提取PRV、PPV、PCV2病毒液DNA，按照SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)體系檢測(cè)上述病毒核酸，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組，驗(yàn)證本研究方法特異性。

1.8?敏感性檢驗(yàn)

對(duì)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)瑢⑾♂尀?1～108拷貝/μL 的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，分析本研究方法檢出的最低拷貝數(shù)。

1.9?對(duì)免疫攻毒小鼠腦組織的檢測(cè)

選取SPF級(jí)BALB/c小鼠10只，乙腦滅活苗免疫小鼠5只，同時(shí)設(shè)空白小鼠5只，6 d后加免，9 d后進(jìn)行腹腔攻毒，JEV J3株F3代100 LD50 （100倍半數(shù)致死量）0.2 mL/只，同時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行腦部空刺，攻毒后每日觀察，取瀕死小鼠的腦部組織，研磨、提取組織RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，通過(guò)本研究方法和普通PCR進(jìn)行檢測(cè)。

2?結(jié)果與分析

2.1?JEV E基因PCR擴(kuò)增與測(cè)序

由圖1可知，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物在1 000～2 000 bp之間，測(cè)序得片段大小為 1 574 bp，與預(yù)計(jì)的片段大小相符。

2.2?標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)x取合適濃度范圍（104～109拷貝/μL）的質(zhì)粒進(jìn)行熒光PCR，并通過(guò)LightCycler 480進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，樣品在該范圍內(nèi)具有良好的擴(kuò)增曲線（圖2）。由圖3可知，倍比稀釋質(zhì)粒樣品在此濃度范圍內(nèi)具有良好的擴(kuò)增曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距為41.24，斜率為-3.761，擴(kuò)增效率為99.5%，誤差為0.019 5，判定系數(shù)R2為0.99。

2.3?重復(fù)性檢測(cè)

為驗(yàn)證熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性，對(duì)每個(gè)稀釋度（104～109拷貝/μL）重組質(zhì)粒樣品設(shè)3個(gè)重復(fù)進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)，由圖4可知，3次重復(fù)的動(dòng)力學(xué)曲線重合，可見(jiàn)熒光定量PCR有很高的可重復(fù)性。

2.4?特異性檢測(cè)

對(duì)豬病毒JEV、PRV、CSFV、PPV、PCV2的核酸及雙蒸水進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，由圖5可知，JEV在5個(gè)循環(huán)左右開(kāi)始起峰，而其他病毒及雙蒸水均在35個(gè)循環(huán)后起峰，均為非特異性起峰，表明該方法具有良好的特異性。

2.5?敏感性檢測(cè)

將10倍梯度稀釋后的質(zhì)粒（100～108拷貝/μL）作為模板，采用建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。由圖6可知，當(dāng)模板濃度為 103拷貝/μL 時(shí)，檢測(cè)結(jié)果仍為有規(guī)律的S型熒光曲線。說(shuō)明本研究方法的最低檢測(cè)限為103拷貝/μL。

2.6?對(duì)免疫攻毒小鼠腦組織的檢測(cè)

由表1、表2可知，采用本研究方法檢測(cè)到對(duì)照組攻毒小鼠的腦組織中乙腦病毒結(jié)果均為陽(yáng)性，且可計(jì)算出組織中的病毒載量，免疫組攻毒小鼠僅1只檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性，而PCR檢測(cè)僅部分結(jié)果呈陽(yáng)性，且無(wú)法計(jì)算出組織中的病毒載量。

3?討論

乙型腦炎是人獸共患病，且自然界中大部分脊椎動(dòng)物均是乙型腦炎病毒易感宿主，提高乙腦病毒檢測(cè)的質(zhì)量和效率對(duì)乙腦病毒的發(fā)現(xiàn)和預(yù)防有重要作用。乙腦病毒感染至產(chǎn)生抗體存在一定的“窗

口期”，故抗體檢測(cè)不利于乙腦的早期診斷[8]。病毒分離與鑒定操作繁瑣、耗時(shí)多、靈敏度不高，不能實(shí)現(xiàn)乙腦病毒的快速檢測(cè)，RT-PCR可獲得很好的檢測(cè)效果，但不能對(duì)病原定量分析。劉衛(wèi)濱等根據(jù)JEV NS5基因[9]、霍紅等根據(jù)E基因分別設(shè)計(jì)引物與探針[10]，建立了TaqMan熒光定量RT-PCR方法，通過(guò)該方法檢測(cè)豬血清樣品的靈敏度可達(dá)10拷貝/μL，但其成本高，需結(jié)合特異性探針。韓國(guó)學(xué)者Jeong等利用熒光染料SYBR Green Ⅰ構(gòu)建實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)JEV方法，將擴(kuò)增區(qū)段選定在3′端非編碼區(qū)（共323 bp），該區(qū)段的GC含量高并存在連續(xù)的G或C，且3′端非編碼區(qū)在病毒基因組中能夠形成一定的空間結(jié)構(gòu)，不利于逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程引物的退火與cDNA合成過(guò)程，所以本研究未將3′端非編碼區(qū)作為擴(kuò)增檢測(cè)分析目的區(qū)段[10]。本研究根據(jù)JEV E基因片段保守序列，設(shè)計(jì)合成熒光定量PCR上下游引物，結(jié)果顯示，本研究方法不僅呈現(xiàn)良好的特異性，檢測(cè)靈敏度也達(dá)到103拷貝/μL，與常規(guī)的PCR方法相比，該方法更精確、更省時(shí)、操作更簡(jiǎn)便。本試驗(yàn)建立了SYBR-Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，選取豬乙型腦炎病毒E基因的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，檢測(cè)結(jié)果為良好的S型熒光曲線，且具有很好的重復(fù)性，能夠靈敏地檢測(cè)出病毒感染的情況。

為了更好地驗(yàn)證本研究建立的熒光定量PCR方法的可操作性、靈敏性、實(shí)用性，利用該方法檢測(cè)攻毒保護(hù)試驗(yàn)中小鼠腦組織的病毒載量，發(fā)現(xiàn)各稀釋質(zhì)粒樣品均具有良好的擴(kuò)增曲線，根據(jù)CT值和標(biāo)準(zhǔn)曲線公式可精確計(jì)算出組織中的初始病毒量，與該方法相比，普通PCR方法有很多陽(yáng)性漏檢。熒光定量PCR檢測(cè)不需要通過(guò)凝膠電泳檢測(cè)和測(cè)序分析，節(jié)約了試驗(yàn)時(shí)間和成本。

本試驗(yàn)建立的SYBR-Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，有助于分析在乙腦的發(fā)病過(guò)程中JEV的動(dòng)態(tài)變化與疾病發(fā)展的關(guān)系以及乙腦病毒感染的早期檢測(cè)和定量分析豬乙腦病毒感染程度。

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