多重實時熒光PCR快速檢測轉(zhuǎn)基因大豆

石盼盼 謝文佳 劉燕 王璐 陳蕾 郝莉花

摘要：采用多重實時熒光PCR技術(shù)，對大豆篩選基因35S啟動子（cauliflower mosaic virus，CaMV 35S）、NOS終止子（nopaline synthase，NOS）和內(nèi)源基因Lectin設(shè)計合成了多對檢測引物和探針，在篩選各基因合適的檢測引物和探針的基礎(chǔ)上，摸索引物組合和擴增條件，最終確定合適的探針引物組合和試驗條件，建立轉(zhuǎn)基因大豆快速初篩技術(shù)。該方法可在1 h內(nèi)同時完成對轉(zhuǎn)基因大豆3個基因片段的實時熒光PCR檢測。方法特異性強，靈敏度高，可用于大豆轉(zhuǎn)基因成分的快速檢測，大大提高檢驗效率，可為消費者的食品安全及我國大豆的進出口檢驗提供有效的技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞：三重實時熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR;大豆;轉(zhuǎn)基因成分;特異性;靈敏度

中圖分類號：S565.101?文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）18-0077-04

收稿日期：2019-11-12

基金項目：河南省科技攻關(guān)計劃（編號：172102310724）。

作者簡介：石盼盼（1987—），女，河南洛陽人，碩士，工程師，主要從事食品安全質(zhì)量檢測研究。E-mail：523150920@qq.com。

大豆?fàn)I養(yǎng)豐富，為人類提供優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)和油脂，是我國重要的糧食油料兼用作物，也是重要的飼料來源[1-2]。我國大豆及相關(guān)產(chǎn)品的消費量在國際上一直名列前茅。以2017年為例，我國消費大豆油1 740萬t，占全球消費總量的309%;消費豆粕7 407萬t，占全球消費總量的317%。隨著健康飲食方式的引導(dǎo)，大豆消費水平不斷上升，但國內(nèi)種植量增長緩慢。近幾年來，我國主要從美國、阿根廷等國家進口大豆[3-4]。在進出口貿(mào)易中大豆及其產(chǎn)品轉(zhuǎn)基因成分是常檢項目。轉(zhuǎn)基因大豆產(chǎn)品因其安全性備受爭議，嚴重影響了人們對大豆的消費熱情。目前，市場監(jiān)督管理及進出口檢驗檢疫部門著重于研究開發(fā)更為科學(xué)高效的轉(zhuǎn)基因大豆檢測技術(shù)，保證非批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因大豆及其產(chǎn)品無法進入我國[5]。

我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部已經(jīng)批準(zhǔn)美國孟山都等公司的多種轉(zhuǎn)基因大豆進口到我國。我國自主研發(fā)的轉(zhuǎn)基因大豆品種也已經(jīng)實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。我國轉(zhuǎn)基因育種技術(shù)的發(fā)展進一步促使基因產(chǎn)品檢測技術(shù)的發(fā)展升級[6]。目前我國國家標(biāo)準(zhǔn)中對轉(zhuǎn)基因大豆的檢測主要以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）法為主。如《農(nóng)業(yè)部2630號公告-15-2017轉(zhuǎn)基因植物及其產(chǎn)品成分檢測耐除草劑大豆SHZD32-1及其衍生品種定性PCR方法》[7]和國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 33526—2017《轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品?數(shù)字PCR檢測方法》[8]。在研究領(lǐng)域多種基于分子生物學(xué)的檢測技術(shù)不斷涌現(xiàn)，但應(yīng)用性方面還有待研究推廣[9-14]。其中，魏霜等利用多重串聯(lián)式PCR基因碟片技術(shù)用于轉(zhuǎn)基因大豆GTS40-3-2的檢測[15]，即利用多重PCR和巢式熒光定量PCR檢測GTS 40-3-2的多個外源基因和內(nèi)源基因，實現(xiàn)了轉(zhuǎn)基因的高通量檢測，但該方法技術(shù)要求高，且檢測方法主要是普通PCR技術(shù)，檢測結(jié)果須要進一步凝膠電泳分析，過程相對復(fù)雜。本試驗研發(fā)的三重實時熒光PCR法可以達到多項國家標(biāo)準(zhǔn)和進出口行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的基因檢測限，并且1次反應(yīng)能同時準(zhǔn)確檢測有無轉(zhuǎn)基因大豆的CaMV 35S、NOS和Lectin 3個基因片斷，試驗時間短，操作簡單，方便技術(shù)推廣應(yīng)用。

1?材料與方法

1.1?試驗材料與試劑

大豆轉(zhuǎn)基因成分陽性質(zhì)控樣品、大豆轉(zhuǎn)基因成分陰性質(zhì)控樣品，均購自中國檢驗檢疫科學(xué)研究院測試評價中心;實時熒光PCR擴增引物和探針（表1），均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;苯酚-三氯甲烷-異戊醇混合液（體積比為25 ∶24 ∶1）、2×PCR MasterMix，均購自北京索萊寶科技有限公司;試驗用水取自筆者所在實驗室 Milli-Q 超純水系統(tǒng)的二級水;其他無水乙醇等均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2?儀器與設(shè)備

Milli-Q超純水系統(tǒng)，購自密理博中國有限公司;HFsafe生物安全柜，購自上海力申科學(xué)儀器有限公司;LightCycle480熒光PCR儀，購自羅氏診斷產(chǎn)品有限公司;Colibri Titertek Berthold超微量分光光度計，購自上?？迫鹕锟萍加邢薰?移液器，購自美國Eppendorf公司;高通量組織研磨器，購自寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.3?試驗方法

1.3.1?基因組DNA的提取

酚三氯甲烷抽提法：稱取50 mg粉狀樣品至1.5 mL離心管中，加入 700 μL DNA提取裂解液，置65 ℃水浴3 h，其間不時振蕩混勻;12 000 r/min離心5 min，轉(zhuǎn)移上清至新的 1.5 mL 離心管中，加入等體積苯酚-三氯甲烷-異戊醇混合液（25 ∶24 ∶1），充分混勻后，12 000 r/min 離心5 min;取上清，加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉溶液，混勻后加入2倍體積預(yù)冷的無水乙醇，-20 ℃靜置3 h，12 000 r/min離心5 min棄去上清;加70%乙醇洗滌1～2次，通風(fēng)柜內(nèi)室溫下晾干，加50 μL TE緩沖液，最終獲得D260 nm/D280 nm在1.8～2.0之間的DNA溶液。

1.3.2?引物和探針的設(shè)計

在美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）數(shù)據(jù)庫查找并拷貝轉(zhuǎn)基因大豆常用外源基因CaMV 35S啟動子/NOS終止子及內(nèi)源基因Lectin的序列，使用NCBI的在線引物設(shè)計功能和生工生物工程（上海）股份有限公司的引物通過在線設(shè)計軟件設(shè)計出針對這3個基因的正向引物、反向引物和熒光探針。分別使用熒光基團FAM、Cy5和HEX作為發(fā)光基團，使用TAMRA、BHQ3和TAMRA作為淬滅基團。設(shè)計的引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3.3?引物及探針特異性測試試驗

分別用以轉(zhuǎn)基因大豆陽性質(zhì)控樣品及陰性質(zhì)控樣品的DNA為模板，按照以下反應(yīng)體系進行反應(yīng)：滅菌蒸餾水 3.4 μL、2×PCR Master Mix 10 μL、正向引物（1 μmol/L）1.8 μL、反向引物（1 μmol/L）1.8 μL，探針（0.25 μmol/L）2 μL、DNA模板（50 ng/μL）1 μL，總體系20 μL。反應(yīng)程序：50 ℃預(yù)變性15 s，95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，變性延伸過程進行45個循環(huán)。退火結(jié)束時采集探針對應(yīng)的單重?zé)晒?，進行單重實時熒光PCR試驗，檢測3個基因?qū)?yīng)的引物及探針的特異性。每個基因擴增設(shè)置陽性樣品、陰性樣品、空白對照，各設(shè)2個重復(fù)。陽性試驗以轉(zhuǎn)基因大豆陽性質(zhì)控樣品DNA為模板，陰性試驗以轉(zhuǎn)基因大豆陰性質(zhì)控樣品DNA為模板，空白對照以無菌水作為擴增模板。

1.3.4?三重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系及程序

在各基因單重PCR檢測對應(yīng)引物探針特異性良好的基礎(chǔ)上，摸索合適的引物配比和試驗條件，進行三重實時熒光PCR試驗，最終三重?zé)晒釶CR檢測體系見表2，擴增程序優(yōu)化結(jié)果如下：95 ℃預(yù)變性15 s;95 ℃ 變性15 s，60 ℃退火延伸1 min，變性延伸過程進行45個循環(huán)。退火結(jié)束時采集探針對應(yīng)的三重?zé)晒饧碏AM、HEX和CY5采集信號，每個基因擴增設(shè)置陽性樣品、陰性樣品、空白對照，各設(shè)2個重復(fù)。陽性試驗以轉(zhuǎn)基因大豆陽性質(zhì)控樣品DNA為模板，陰性試驗以轉(zhuǎn)基因大豆陰性質(zhì)控樣品DNA為模板，空白對照以無菌水為擴增模板。

1.3.5?三重?zé)晒釶CR檢測體系的靈敏度試驗

將轉(zhuǎn)基因大豆陽性質(zhì)控樣品和轉(zhuǎn)基因陰性玉米樣品以質(zhì)量1 ∶9混合均勻，以“1.3.1”節(jié)的方法提取DNA， 再10倍逐級稀釋使陽性DNA占1%、0.1%。然后以大豆轉(zhuǎn)基因陽性質(zhì)控樣品DNA和陽性占比為10%、1%、0.1%的質(zhì)控樣品DNA為模板，按“13.5”節(jié)三重?zé)晒釶CR反應(yīng)體系及程序進行PCR擴增，每個模板設(shè)置2個重復(fù)，觀察擴增情況，記錄各DNA的擴增循環(huán)數(shù)（CT）。

2?結(jié)果與分析

2.1?引物探針特異性檢測結(jié)果

2.1.1?CaMV 35S基因擴增用引物和探針特異性檢測結(jié)果

如圖1所示，只有以轉(zhuǎn)基因大豆陽性質(zhì)控樣品DNA為模板時才有特異性擴增，2個平行樣品的CT值為分別為23.61、24.55，而其他樣品DNA沒有擴增。說明設(shè)計合成的大豆轉(zhuǎn)基因CaMV35S啟動子檢測用引物和探針特異性良好，沒有交叉反應(yīng)。

2.1.2?大豆內(nèi)源Lectin基因擴增用引物和探針特異性檢測結(jié)果

如圖2所示，當(dāng)以轉(zhuǎn)基因大豆陽性質(zhì)控樣品和陰性質(zhì)控樣DNA為模板時才有特異性擴增，2個平行樣品的CT值分別為23.61、24.55和27.03、26.69。而非大豆樣品DNA和空白對照DNA均沒有擴增。說明設(shè)計合成的大豆內(nèi)源基因Lectin檢測用引物和探針特異性良好，沒有交叉反應(yīng)。

2.1.3?NOS終止子基因擴增用引物和探針特異性檢測結(jié)果

如圖3所示，只有以轉(zhuǎn)基因大豆陽性質(zhì)控樣品DNA為模板時才有特異性擴增，CT值分別為28.14、28.02，而其他樣品DNA沒有擴增。說明設(shè)計合成的大豆轉(zhuǎn)基因NOS終止子檢測用引物和探針特異性良好，沒有交叉反應(yīng)。

2.2?三重實時熒光PCR體系擴增圖結(jié)果

如圖4、圖5、圖6所示，三重體系中陽性樣品各基因均有典型的“S”形擴增，陰性樣品除Lectin基因外其余都沒有擴增，試劑空白和提取過程空白均沒有擴增。說明建立的三重PCR體系擴增特異性良好，體系成立。

2.3?多重PCR體系的靈敏度測定

由圖7、圖8、圖9、表3可知，構(gòu)建的三重擴增體系中CaMV 35S基因、Lectin基因和NOS的檢測靈敏度均可以達到樣品質(zhì)量濃度的0.1%。

3?結(jié)論

本研究利用多重?zé)晒釶CR的優(yōu)勢，建立了可同時檢測轉(zhuǎn)基因大豆啟動子35S、終止子NOS和內(nèi)源基因Lectin的三重實時熒光PCR方法，可以通過1次PCR實現(xiàn)對大豆樣品的轉(zhuǎn)基因初級篩查。特異性和靈敏度檢測證明該方法可用于大豆樣品的轉(zhuǎn)基因檢測，大大提高了檢測效率，操作過程簡單宜于推廣，對進一步促進分子生物學(xué)技術(shù)在檢驗檢測領(lǐng)域的應(yīng)用有一定的推動作用。但該方法中NOS在三重體系中顯示檢測熒光值偏低，可能與CY5熒光值較弱有關(guān)，該體系也有待進一步優(yōu)化，在不同品牌PCR儀間的適用性問題也有待進一步驗證。

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