番茄Mi-1基因調(diào)控元件及同源基因進化分析

劉子記 劉維俠 牛玉 楊衍

摘要：為闡明Mi-1基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件及同源基因進化特點，從番茄品種京番308中克隆Mi-1基因起始密碼子上游序列，選取轉(zhuǎn)錄起始位點上游1 432 bp的序列進行啟動子順式調(diào)控元件分析，分析結(jié)果表明，Mi-1啟動子除了含有核心元件外，還含有光響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件、防御與脅迫響應(yīng)元件等。Mi-1同源基因進化分析結(jié)果表明，Mi-1同源基因既包括旁系同源基因，也包括直系同源基因。當(dāng)同源指數(shù)為0.70時，番茄、馬鈴薯、辣椒中含有Mi-1同源基因，與辣椒相比，番茄與馬鈴薯的親緣關(guān)系更近。結(jié)果可為進一步研究 Mi-1基因的調(diào)控表達和進化規(guī)律奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：番茄;根結(jié)線蟲抗性;啟動子;同源基因;基因進化;順式調(diào)控元件

中圖分類號： S436.412文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）18-0066-06

收稿日期：2019-09-20

基金項目：海南省科技項目（編號：ZDYF2018035）;中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費專項（編號：1630032017027）;農(nóng)業(yè)農(nóng)村部財政專項（編號：NFZX2018）。

作者簡介：劉子記（1982—），男，山東菏澤人，博士，副研究員，主要從事蔬菜遺傳育種研究。E-mail：liuziji1982@163.com。

通信作者：楊?衍，博士，研究員，主要從事蔬菜遺傳育種研究。E-mail：catasvegetable@163.com。

根結(jié)線蟲（Meloidogyne spp.）病是農(nóng)作物最常見的病害之一，根結(jié)線蟲環(huán)境適應(yīng)性強，在世界各地均有分布，寄生范圍廣，可侵染3 000多種植物[1]。南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲和北方根結(jié)線蟲是發(fā)生最為普遍的4種線蟲[2]。根結(jié)線蟲可造成作物減產(chǎn)10%～20%，嚴重時高達75%以上[3]。另外，根結(jié)線蟲還能與真菌和細菌形成復(fù)合侵染，加劇土傳病害的發(fā)生，造成更加嚴重的經(jīng)濟損失[4-5]。據(jù)估計，世界范圍內(nèi)每年由根結(jié)線蟲造成的損失超過1 200億美元[6]。

番茄（Solanum lycopersicum）是易感根結(jié)線蟲的作物，根結(jié)線蟲侵染番茄根系后，會造成番茄株高和產(chǎn)量顯著降低，果實品質(zhì)變差[7-8]，已成為番茄產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要障礙[9]。以往防治根結(jié)線蟲主要采用輪作、化學(xué)防治等方法。輪作具有較大的局限性，在特定地區(qū)無法達到合理輪作的要求[10]。采用化學(xué)防治方法對土壤進行消毒，不僅會降低蔬菜品質(zhì)，嚴重破壞土壤生態(tài)系統(tǒng)[11]，而且會導(dǎo)致線蟲抗藥性增強，蟲口密度上升[12]。培育抗病品種是防御番茄根結(jié)線蟲病最為經(jīng)濟、有效的方法[13]。1956年Gibert研究發(fā)現(xiàn)，秘魯番茄對根結(jié)線蟲的抗性由1個顯性基因Mi控制，Mi基因被定位在番茄第6號染色體的短臂端[14]。Kaloshian等采用圖位克隆的方法從野生番茄中分離到Mi基因[15-16]。之后研究人員相繼發(fā)現(xiàn)了9個抗根結(jié)線蟲基因[17]，抗性位點Mi被表示為Mi-1。Mi-1基因是目前被開發(fā)利用最為廣泛的抗根結(jié)線蟲病基因[18]，能有效抵抗南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲3種主要根結(jié)線蟲的侵染[19]。植物對根結(jié)線蟲的抗性表現(xiàn)為過敏性反應(yīng)，當(dāng)根系受到根結(jié)線蟲侵染時，被侵染部位周圍的植物組織內(nèi)發(fā)生細胞壞死，從而限制根結(jié)線蟲的取食和抑制其生長發(fā)育，最終致使根結(jié)線蟲死亡[20]。Mi-1基因抗性機制還有很多方面未被揭示，有關(guān)Mi-1啟動子特征和同源基因進化的研究鮮有報道。因此，本研究擬克隆Mi-1基因的上游啟動子序列，分析順式調(diào)控元件，另外，基于同源指數(shù)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹和基因進化折線圖，旨在為進一步闡明Mi-1抗性機制和促進其有效應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1?材料與方法

1.1?材料

供試材料為京番308，屬于粉果番茄雜交種，早熟，無限生長型，綠肩，果實圓形，每穗坐果數(shù)4～6個，單果質(zhì)量80～120 g，耐裂性好，汁多味濃，具有Mi-1、Tm2a等基因位點，由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心提供。試驗于2018年8月在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院儋州試驗基地進行，將供試番茄種子播種于育苗盤中，待長至4葉1心時，摘取葉片，采用改良的十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[21]提取番茄材料的基因組DNA。

1.2?方法

1.2.1?Mi-1啟動子序列克隆

為了獲得Mi-1啟動子序列，參照GenBank中的Mi-1編碼序列AF039682和番茄基因組序列（https：//solgenomics.net/），根據(jù)Mi-1基因起始密碼子下游600 bp內(nèi)的序列利用軟件Primer 5.0設(shè)計引物（正向引物序列5′→3′：CTGCAAAGTTTCTCCGCTTAT，反向引物序列5′→3′：CAAAATCGGAATAAGAAAGC），以京番308葉片基因組DNA為模板進行擴增，目的條帶的回收采用離心柱型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，將目的條帶進行連接、轉(zhuǎn)化，篩選3個陽性克隆，委托英韋創(chuàng)津生物科技有限公司進行測序。

PCR反應(yīng)體系包括6 μL Premix TaqTM，150 ng模板DNA和1 μmol/L引物，添加ddH2O補足 10 μL。擴增程序為95 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性50 s，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，40個循環(huán);72 ℃ 終延伸 8 min;PCR產(chǎn)物最后于4 ℃下保存。取10 μL擴增產(chǎn)物與 2 μL Ultra Power DNA染料和2 μL上樣緩沖液混合均勻，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳20 min后，顯色進行帶型分析。

1.2.2?Mi-1啟動子序列分析

Mi-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點利用在線軟件FGENESH進行預(yù)測。Mi-1 啟動子順式調(diào)控元件利用P1antCARE[22]軟件進行預(yù)測。

1.2.3?Mi-1同源基因系統(tǒng)發(fā)育分析

首先通過BLASTP比對確定Gcorn數(shù)據(jù)庫中與Mi-1同源性較高的基因序列，結(jié)合BLASTP分析結(jié)果，計算基因?qū)χg的同源性指數(shù)（HI）?；贖I值對同源基因進行分組，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹、基因進化折線圖和同源基因在物種相關(guān)網(wǎng)絡(luò)中的分布圖。

2?結(jié)果與分析

2.1?Mi-1基因啟動子克隆

為了獲得Mi-1啟動子序列，根據(jù)Mi-1起始密碼子下游600 bp內(nèi)的序列利用軟件Primer 5.0設(shè)計引物，以京番308葉片基因組DNA為模板，進行PCR擴增，獲得大小為2 045 bp的序列，經(jīng)與 Mi-1 編碼序列比對發(fā)現(xiàn)，其位于1 523 bp處，起始密碼子ATG下游編碼序列與Mi-1編碼序列相匹配，說明所克隆序列為Mi-1基因上游啟動子序列。采用在線軟件FGENESH預(yù)測Mi-1轉(zhuǎn)錄起始位點位置，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄起始位點位于1 435 bp處（A），位于起始密碼子上游338 bp處。選取轉(zhuǎn)錄起始位點上游1 432 bp序列進行啟動子區(qū)域順式作用元件預(yù)測。

2.2?Mi-1基因啟動子序列分析

利用P1antCARE軟件分析Mi-1基因啟動子序列，結(jié)果（圖1、表1）發(fā)現(xiàn)，Mi-1基因啟動子序列中存在多個順式作用元件。除了含有TATA-box、CAAT-box等核心元件外，還發(fā)現(xiàn)多個光響應(yīng)元件，如AE-box、ATC-motif、Box 4、G-box、GATA-motif等;植物激素響應(yīng)元件，如脫落酸響應(yīng)元件ABRE;防御與脅迫響應(yīng)元件，如TC-rich repeats;茉莉酸甲酯響應(yīng)元件，如CGTCA-motif和TGACG-motif;低溫誘導(dǎo)元件，如LTR。預(yù)測結(jié)果說明，該啟動子的表達可能受光、脫落酸、逆境脅迫、低溫和茉莉酸甲酯等的誘導(dǎo)。

2.3?Mi-1同源基因進化樹構(gòu)建

由于Gcorn數(shù)據(jù)庫無Mi-1基因序列，為了進行Mi-1同源基因進化分析，首先利用NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）基于Mi-1基因序列AF039682.1進行同源比對，結(jié)果顯示，與番茄XM_004240451.4的序列一致性最高，達9539%，XM_004240451.4對應(yīng)的基因ID為101 244 292，對應(yīng)的蛋白質(zhì)ID為XP_004240499.1，利用XP_004240499.1基于Gcorn數(shù)據(jù)庫進一步開展 Mi-1 同源基因進化分析?；赬P_004240499.1和與其同源性最高的20條蛋白質(zhì)序列構(gòu)建Mi-1同源基因系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果（圖2）表明，XP_004240499.1 與番茄XP_010321826同源性最高，同源性指數(shù)為1.00，與潘那利番茄 XP_015078201 的同源性指數(shù)為0.93，與馬鈴薯 XP_015160128 的同源性指數(shù)為0.80，與辣椒 XP_016575993 的同源性指數(shù)為0.71。同源基因進化分析結(jié)果表明，番茄中Mi-1同源基因與馬鈴薯中Mi-1同源基因的親緣關(guān)系較近，其次為辣椒。

2.4?Mi-1同源基因進化分析

為了簡化系統(tǒng)發(fā)育樹的特征，構(gòu)建Mi-1同源基因進化折線圖。當(dāng)同源指數(shù)為1.00時，共包括2條蛋白序列，屬于旁系同源基因。同源指數(shù)為093時，潘那利番茄和普通番茄含有Mi-1的同源基因，同源基因?qū)儆谥毕低椿颉Ｍ粗笖?shù)為081時，

潘那利番茄、普通番茄和馬鈴薯含有Mi-1同源基因，同源基因?qū)儆谥毕低椿颍▓D3）。在物種相關(guān)網(wǎng)絡(luò)（圖4）中，節(jié)點代表物種，藍色節(jié)點代表該物種包含Mi-1的同源基因，當(dāng)同源指數(shù)為0.70時，潘那利番茄、普通番茄、馬鈴薯、辣椒含有Mi-1的同源基因。綜上所述，茄科作物番茄、馬鈴薯和辣椒中含有Mi-1的同源基因，同源基因既包括旁系同源基因，也包括直系同源基因。

3?討論與結(jié)論

隨著保護地番茄栽培面積的增大以及復(fù)種指數(shù)的增加，根結(jié)線蟲危害日趨嚴重[23-24]。番茄Mi-1基因是目前被廣泛開發(fā)利用的抗根結(jié)線蟲病基因。Mi-1調(diào)控元件的不斷發(fā)現(xiàn)及同源基因系統(tǒng)進化的深入研究，將有助于揭示抗病基因在發(fā)揮抗性過程中的調(diào)控方式。啟動子含有轉(zhuǎn)錄起始所需的保守序列和RNA聚合酶特異性結(jié)合位點，是調(diào)控基因表達的重要組成部分。本研究選取番茄抗根結(jié)線蟲 Mi-1基因轉(zhuǎn)錄起始位點（TSS）上游1 432 bp的序列作為啟動子序列進行順式調(diào)控元件分析，分析結(jié)果顯示，該啟動子除含有CAAT-box和TATA-box等核心作用元件外，還含有多個光響應(yīng)元件。

Tameling等研究發(fā)現(xiàn)，Mi-1具有結(jié)合和水解ATP的活性[25]。由于ATP是植物在有光條件下，通過光反應(yīng)過程合成的，推測光對于誘導(dǎo)和調(diào)控 Mi-1 的基因表達具有重要作用。

另外，Mi-1啟動子區(qū)域還含有茉莉酸響應(yīng)原件，這與Cooper等的研究結(jié)果[26]一致，Cooper等的研究結(jié)果表明，Mi-1介導(dǎo)的根結(jié)線蟲抗性在32 ℃時有所降低，茉莉酸處理可以增強高溫下Mi-1介導(dǎo)的根結(jié)線蟲抗性[26]。Mi-1啟動子區(qū)域含有脅迫響應(yīng)元件，這與Guo等的研究結(jié)果[27]相吻合，Guo

等的研究表明，厭氧脅迫可以增強番茄材料的水楊酸信號通路[27]。水楊酸信號通路對于誘導(dǎo)Mi-1基因產(chǎn)生對根結(jié)線蟲的抗性具有重要作用[28]。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，Mi-1啟動子區(qū)域含有脫落酸響應(yīng)元件，進一步推測Mi-1基因受激素和脅迫的誘導(dǎo)表達。

Mi-1同源基因系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明，番茄、馬鈴薯和辣椒中存在多個Mi-1同源基因，尤其番茄中最多，這可能是由基因重復(fù)和基因轉(zhuǎn)換引起的，這與Segura等的研究結(jié)果[29-30]一致。番茄 Mi-1 同源基因編碼的蛋白XP_004240499.1與馬鈴薯Mi-1同源基因編碼蛋白的同源指數(shù)高于辣椒，進一步說明與辣椒相比，番茄與馬鈴薯的親緣關(guān)系更近，這與基于基因組序列構(gòu)建的物種間相關(guān)關(guān)系一致（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/taxonomy）。Mi-1 同源基因在潘那利番茄、普通番茄、馬鈴薯、辣椒中既包括旁系同源基因，也包括直系同源基因。這可能是由Mi-1同源基因在基因組上常成簇存在，基因拷貝間發(fā)生頻繁的序列交換引起的，這與Sanchez-Puerta等的研究結(jié)果[31]一致。本研究結(jié)果表明，Mi-1同源基因在茄科作物基因組進化過程中發(fā)生過多次基因復(fù)制與基因轉(zhuǎn)換事件。

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