稻瘟病菌細胞周期控制蛋白的生物信息學分析

方淑梅 侯雪 邱凱華 孔祥森 鞠世杰 梁喜龍

摘要：稻瘟病菌是重要的模式致病真菌，該菌引發(fā)的稻瘟病也是全球水稻最嚴重的病害之一，因此對稻瘟病菌的研究具有重要的學術意義和實際價值。細胞周期受多層次、多因子共同調控，其相關控制蛋白在真菌的形態(tài)建成、發(fā)育分化、逆境適應及致病性等方面發(fā)揮重要作用。為明確稻瘟病菌細胞周期控制蛋白的生物信息學特性，利用多種生物信息學軟件和網(wǎng)站對獲得的3種細胞周期控制蛋白Cwf19、Cwf16和Cwf14的理化性質、亞細胞定位、分子進化、翻譯后修飾、空間結構、互作蛋白等進行分析，探討了其可能的作用機制，為進一步利用反向遺傳學手段深入研究其生物學功能奠定基礎。

關鍵詞：稻瘟病菌;細胞周期控制蛋白;生物信息學

中圖分類號：S435.111.4+1?文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）18-0060-06

收稿日期：2020-07-08

基金項目：黑龍江省自然科學基金（編號：C2016047）;黑龍江省教育廳項目（編號：12531452）;黑龍江八一農(nóng)墾大學研究生創(chuàng)新科研項目（編號：YJSCX2019-Y14）。

作者簡介：方淑梅（1977—），女，遼寧東港人，博士，副教授，主要從事植物逆境分子生物學等方面的教學和科研工作。E-mail：fangshumei520@126.com。

通信作者：梁喜龍，博士，教授，主要從事植物化控及生物逆境方面研究。E-mail：xilongliang@126.com。

稻瘟病菌（Pyricularia oryzae or Magnaporthe oryzae）是重要的模式植物致病真菌，在真菌的科學研究中具有重要地位。而且由稻瘟病菌引起的稻瘟病是在世界范圍內嚴重影響水稻產(chǎn)量和品質的最嚴重的病害之一，調查顯示全球受影響國家多達80個，每年受稻瘟病災害導致的水稻減產(chǎn)率高達全世界水稻總產(chǎn)量的10%～30% [1]。而我國一直以來水稻種植業(yè)飽受稻瘟病的困擾，每年的產(chǎn)量損失高達30億kg以上。另外稻瘟病菌還可侵染小麥、大麥和黍等禾本科作物[2]。因此對稻瘟病菌致病分子機制的研究對于發(fā)現(xiàn)防治稻瘟病菌的特異性作用靶點，為高效藥物研發(fā)提供科學可行的重要理論基礎。

細胞周期是受多層次、多因子共同調控的影響細胞分裂、分化和凋亡等所經(jīng)歷的過程。 細胞周期控制蛋白（cell cycle control protein）參與細胞正常運轉的蛋白質，是真核生物生命進程中重要的調控因子，可通過調控細胞周期而參與生命體的形態(tài)建成、生長發(fā)育、細胞分化、環(huán)境適應及疾病發(fā)生等諸多過程[3-8]。研究顯示，許多pre-mRNA剪接因子是重要的細胞周期控制蛋白，通過參與剪接體的形成與RNA或其他蛋白結合而在剪接過程中發(fā)揮作用，從而影響基因表達[9-13]。

隨著稻瘟病菌基因組數(shù)據(jù)庫的公布以及遺傳重組手段的日益成熟，稻瘟病菌致病相關基因挖掘工作取得重要進展[14-15]。然而對稻瘟病菌細胞周期控制蛋白的研究仍然較少。為此，筆者所在實驗室利用生物信息學方法分析了稻瘟病菌中的細胞周期控制蛋白的分子進化、理化性質、結構特征、序列特征及互作蛋白等，探討其可能的作用機制，旨在為進一步利用反向遺傳學手段研究其生物學功能奠定基礎。

1?材料與方法

1.1?稻瘟病菌細胞周期控制蛋白的獲取與確定

利用稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http：//fungi.ensembl.org/Magnaporthe_oryzae/Info/Index），輸入檢索詞“cell cycle control protein”搜索，獲取所有細胞周期控制蛋白的基因ID和基因在染色體中的位置、外顯子數(shù)、編碼外顯子數(shù)等信息，并利用MapChart 2.2軟件，參照基因和染色體長度按比例進行繪制。

1.2?稻瘟病菌細胞周期控制蛋白的理化特性及修飾位點預測

利用在線工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam）預測稻瘟病菌細胞周期控制蛋白的親水性和穩(wěn)定性;利用在線軟件SignalP-5.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測蛋白質信號肽，參數(shù)設置為默認值。利用在線軟件DISPHOS1.3（http：//www.dabi.temple.edu/disphos/）預測蛋白質磷酸化位點，利用軟件GPS-SUMO 1.0預測蛋白質的Sumo化位點，Sumoylation threshold和SUMO interaction threshold均設置為中等。

1.3?稻瘟病菌細胞周期控制蛋白的系統(tǒng)進化分析

將稻瘟病菌細胞周期蛋白的氨基酸序列提交到NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov），利用序列同源性獲取同源蛋白，整理為.fasta格式，然后利用軟件ClustalX 1.83進行氨基酸序列的多重匹配分析，參數(shù)設為默認值，進一步用MEGA 4.0軟件轉化為.meg文檔后，利用Neighbor-Joining法繪制系統(tǒng)進化樹。

1.4?稻瘟病菌細胞周期控制蛋白的空間結構預測

首先利用在線軟件NPS@SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？ page=/NPSA/npsa_sopma.html）進行二級結構分析，窗口寬度17，相似性閾值8。利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）在線網(wǎng)站預測蛋白質的三級結構，獲取3D模型及相關信息。

1.5?稻瘟病菌細胞周期控制蛋白的互作蛋白分析

互作蛋白預測利用STRING 11.0在線軟件（https：//string-db.org/cgi/input.pl）進行，minimum required interaction score 設置為高置信度（high confidence）0.700，互作蛋白來源于試驗證實（Experiments）。

2?結果與分析

2.1?稻瘟病菌細胞周期控制蛋白及基因信息確定

通過在稻瘟病菌數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站搜索，獲得注釋為細胞周期控制蛋白的基因ID共3個，分別為 MGG_00102、MGG_12308和MGG_06309（表1），其所對應的蛋白分別為Cwf19、Cwf16和Cwf14，來源菌株均為Pyricularia oryzae 70-15。

2.2?稻瘟病菌細胞周期控制蛋白基因的染色體定位

由表1和圖1可見，3種稻瘟病菌細胞周期蛋白基因MGG_00102、MGG_12308和MGG_06309分別位于5號、2號和4號染色體上，其中MGG_00102位于染色體末端，而MGG_12308和MGG_06309均分布在靠近染色體末端1/4處。

2.3?稻瘟病菌細胞周期控制蛋白的理化特性與亞細胞定位

由表2可以看出，3種蛋白質的分子量差異較大，其中Cwf14分子量最小，為17 161.75 g/mol，Cwf16大約是它的2倍，而Cwf19分子量最大，大約是它的5倍;在等電點方面，Cwf14偏堿性，而Cwf19和Cwf16偏中性;3種蛋白均為不穩(wěn)定的親水性蛋白，均無信號肽，亞細胞定位分析顯示Cwf19和Cwf14僅存在于細胞核，Cwf16除位于細胞核外，還參與細胞骨架構成。

2.4?稻瘟病菌細胞周期控制蛋白修飾位點預測

利用DISPHOS在線網(wǎng)站預測細胞周期控制蛋白磷酸化修飾位點顯示，Cwf19磷酸化位點共20個， 其中Ser 15個、Thr 2個、Tyr 3個;Cwf16磷酸化位點共5個，其中Ser 4個、Thr 1個，無Tyr磷酸化;Cwf14中無磷酸化位點。GPS-SUMO軟件預測3種蛋白質的SUMO化位點結果如表3所示，Cwf19的具有1個SUMO化位點（181Lys）;Cwf16具有2個SUMO化位點（28Lys和156Lys）和1個SUMO互作基序（185-189Val-Val-Val-Ala-Gln）;Cwf14具有1個SUMO化位點（129Lys）。其中，距離Cwf19 SUMO化位點最近的磷酸化位點為173 Ser和190Ser，距離Cwf16 SUMO化位點最近的磷酸化位點為21Thr、36Thr和152Thr。

2.5?稻瘟病菌細胞周期控制蛋白的系統(tǒng)進化分析

為了明確稻瘟病菌細胞周期控制蛋白的進化關系，本研究利用MEGA 4.0軟件，采用Neighbor-Joining法繪制了系統(tǒng)進化樹。如圖2所示，3 種細胞周期控制蛋白均各自形成一組分支，表明他們在真菌的不同種屬間具有保守性。其中Cwf19，稻瘟病菌與小麥全蝕病菌（Gaeumannomyces tritici）聚在一起，具有相同節(jié)點，親緣關系最近，而與新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）親緣關系最遠;對于Cwf16，稻瘟病菌與Microdochium bolleyi和Phaeoacremonium minimum具有較近的親緣關系，與二孢白粉菌（Golovinomyces cichoracearum）的親緣關系最遠;而Cwf14與稻瘟病菌親緣關系最近的是夏季斑枯病菌（Magnaporthiopsis poae），與向日葵間座殼菌（Diaporthe helianthi）的親緣關系最遠。

2.6?稻瘟病菌細胞周期控制蛋白二級結構預測

本研究中細胞周期控制蛋白二級結構預測結果如圖3所示。由圖3可以看出，3種細胞周期控制蛋白的二級結構均以α螺旋為主，所占比例遠高于其他2種形式。另外，Cwf16的α螺旋、β折疊和β轉角所占比例均最高于另外2種蛋白，表明其無規(guī)卷曲所占比例最小。

2.7?稻瘟病菌細胞周期控制蛋白的三級結構

正確的空間構象是蛋白質具有特定生物學功能的前提。本研究利用在線預測軟件SWISS-MODEL預測細胞周期控制蛋白的3D結構，結果如表4和圖4所示。Cwf19的預測模板為6id0.1.R，三級結構由2個大小不同的可能的結構域構成;Cwf16的預測模板為6exn.1.F，三級結構由1個結構域和1個αα超二級結構構成;Cwf14的預測模板為3jb9.1.Z，為由1個結構域構成的蛋白質分子。

2.7?稻瘟病菌細胞周期控制蛋白的互作蛋白預測分析

很多蛋白質分子尤其是調控蛋白，在細胞內通常都會與其他調控蛋白相互作用而發(fā)揮功能。本研究利用STRING在線軟件分別對3種細胞周期控制蛋白的互作蛋白進行預測。所有互作蛋白分子均來源于試驗證實，最低互作閾值（minimum required interaction score） 設置為0.700。結果如表5所示，這3個蛋白的互作蛋白均為pre-mRNA剪接/加工因子或剪接體的組分，而且有些為他們共同的互作蛋白，如MGG_08133和MGG_08641同時與Cwf19、Cwf16和Cwf14互作，除此之外，MGG_01426和MGG_03116是Cwf19與Cwf16共同的互作蛋白，MGG_05616是Cwf19與Cwf14共同的互作蛋白，MGG_13500是Cwf16與Cwf14共同的互作蛋白。因此他們可能在pre-mRNA剪接過程中共同發(fā)揮作用。

3?結論與討論

對細胞周期調控的探索一直是真核生物重要的研究內容之一。在真菌，許多細胞周期相關蛋白不斷地被發(fā)現(xiàn)和解讀，如Cln家族、Clb家族等，他們通過參與相關的信號通路而調控細胞的生長、發(fā)育以及致病菌株的毒力 [16-17]。除了這些直接作用的蛋白質家族之外，細胞核中存在大量的調控蛋白，如剪接體構成蛋白及剪接因子，他們通過調控基因表達而參與細胞周期的控制[9-13]。本研究中的3種細胞周期控制蛋白均存在于細胞核內，以α螺旋為主要二級結構的不穩(wěn)定親水性蛋白，他們的互作蛋白均為pre-mRNA剪接/加工因子或剪接體組分，因此推測這3種蛋白也是pre-mRNA剪接/加工因子或參與剪接體構成的蛋白質，參與 pre-mRNA 剪接或選擇性剪接。而且這3種蛋白在發(fā)揮作用時具有共同的互作蛋白，并且其中的MGG_01426和MGG_08641都參與細胞周期的控制過程，表明他們可能在共同的調控細胞周期運轉的途徑中發(fā)揮作用。

SUMO（small ubiquitin-like modifier）化修飾通常指SUMO分子（76個氨基酸構成的肽）通過其C端Gly結合于目的蛋白質分子的Lys殘基上，也有些SUMO分子通過目的蛋白的SUMO互作基序（SUMO-interacting motifs，SIMs）與之結合，是常見的翻譯后修飾過程[18-19]。研究顯示SUMO化修飾參與蛋白質的多種功能調節(jié)，包括影響蛋白質的穩(wěn)定性、核酶活性、蛋白質之間的相互作用、蛋白質與核酸結合及亞細胞定位等[20-25]。本研究中的3個細胞周期蛋白均具有結合SUMO分子的位點或互作基序，因此SUMO化修飾可能在其發(fā)揮分子定位或參與剪接體組裝及作用中發(fā)揮作用。然而研究顯示并不是所有預測可能的SUMO位點都會真正地被SUMO分子結合，磷酸化修飾也可能在底物的SUMO化中發(fā)揮重要作用。Hietakangas等報道Lys-x-Glu-x-x-Ser-Pro是SUMO化位點的一致性序列，其中Ser的磷酸化可影響Lys的SUMO化 [26-27]。雖然本研究并未在這3種細胞周期控制蛋白中發(fā)現(xiàn)這種保守的序列，但是磷酸化與SUMO化之間的關系值得深入研究。

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