南、北五味子藥材的HPLC指紋圖譜建立及化學(xué)模式識(shí)別分析

郭麗 楊忠杰 于曉濤 賈陸 金少舉 王瑞

摘 要 目的：建立南、北五味子藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并進(jìn)行化學(xué)模式識(shí)別分析。方法：采用HPLC法，以五味子甲素為參照，繪制南、北五味子各10批樣品（編號(hào)分別為N1～ N10、S1～ S10）的HPLC指紋圖譜;采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，確定共有峰;采用SPSS 20.0和SIMCA 14.1軟件進(jìn)行聚類分析（HCA）、無監(jiān)督模式主成分分析（PCA）、有監(jiān)督模式正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）;以變量重要性投影值（VIP）大于1為標(biāo)準(zhǔn)，篩選影響南、北五味子質(zhì)量的差異標(biāo)志物。結(jié)果：南、北五味子分別指認(rèn)出32、33個(gè)共有峰;10批南五味子和10批北五味子的相似度均大于0.9，南、北五味子的相似度為0.50;南、北五味子共有19個(gè)共有特征峰，共指認(rèn)出其中的5個(gè)，即五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素。HCA結(jié)果顯示，N1～N10聚為一類，S1～S10聚為一類，其中N1、N3、N8、N9聚為一類，其余聚為一類;S1、S3、S6、S9聚為一類，其余聚為一類。無監(jiān)督模式PCA結(jié)果顯示，前2個(gè)主成分因子的累積方差貢獻(xiàn)率為87.19%。有監(jiān)督模式OPLS-DA結(jié)果顯示，五味子甲素、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子乙素為影響南、北五味子藥材質(zhì)量的差異標(biāo)志物（VIP值分別為2.29、2.24、1.73、1.48）。結(jié)論：本研究所建立南、北五味子HPLC指紋圖譜準(zhǔn)確、科學(xué)、簡(jiǎn)便易行，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析可用于評(píng)價(jià)南、北五味子藥材的質(zhì)量。南、北五味子成分有所不同，五味子甲素等為差異標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞 南五味子;北五味子;高效液相色譜法;指紋圖譜;聚類分析;主成分分析;正交偏最小二乘法-判別分析;差異標(biāo)志物

中圖分類號(hào) R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）18-2224-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.18.09

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish HPLC fingerprint of Schisandra sphenanthera and S. chinensis， and to analyze chemical pattern recognition. METHODS： HPLC method was adopted. Using schizandrin A as reference， HPLC fingerprints of 10 batches of S. sphenanthera and S. chinensis （N1-N10， S1-S10） were drawn. Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprint （2012 edition） was adopted for similarity evaluation to determine the common peaks. SPSS 20.0 and SIMCA 14.1 software were used for HCA， unsupervised madel of PCA， supervised model of OPLS-DA. Using variable importance projection （VIP） value greater than 1 as the standard， the differential markers that affected the quality of S. sphenanthera and S. chinensis were screened. RESULTS： S. sphenanthera and S. chinensis were identified 32 and 33 common peaks， respectively. The similarity of 10 batches of S. sphenanthera and 10 batches of S. chinensis were all higher than 0.9， and the similarity of S. sphenanthera and S. chinensis was 0.05. A total of 19 characteristics peaks were identified， among which five common peaks were identified as schisandraol A， schisandraol B， schisantherin A， schizandrin A and schisandrin B by reference. HCA results showed that N1-N10 were clustered into one category， and S1-S10 were clustered into one category， of which N1， N3， N8， and N9 were clustered into one category， and the rest were clustered into one category; S1， S3， S6， and S9 were grouped together， and the rest were grouped together. The results unsupervised model of PCA showed that the cumulative variance contribution rate of the first two principal component factors was 87.20%. Supervised model of OPLS-DA showed that schizandrin A， schisandraol A， schisantherin A and schisandrin B were the differential markers that affected the quality of S. sphenanthera and S. chinensis（VIPs were 2.29， 2.24，1.73，1.48， respectively）. CONCLUSIONS： The established fingerprint is accurate， scientific， simple and easy to use， combined with multivariate statistical analysis can be used to evaluate the quality of S. sphenantherae and S. chinensis. The components of S. sphenanthera and S. chinensis were different， schisanolrin A is differential marker.

KEYWORDS? ?Schisandra sphenanthera; Schisandra chinensis; HPLC; Fingerprint; HCA; PCA; OPLS-DA; Differential markers

五味子為木蘭科植物五味子[Schisandra chinesis （Turcz.） Baill.]的干燥成熟果實(shí)，習(xí)稱“北五味子”;南五味子為木蘭科植物華中五味子（S. sphenanthera Rehd. et Wils.）的干燥成熟果實(shí)。兩者在2015年版《中國(guó)藥典》（一部）中均有記載，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)雖有不同，但性味、歸經(jīng)、功能主治的表述卻完全相同[1]。歷代本草典籍中，有關(guān)兩種五味子的產(chǎn)地、名稱、功效等記載不一，如《本草圖經(jīng)》中記載，“五味子，生齊山山谷及代郡，今河?xùn)|、陜西州郡尤多，而杭越間亦有”[2]。根據(jù)其產(chǎn)地查閱《中藥材產(chǎn)銷》[3]可推斷，此處“齊山山谷及代郡”為北五味子產(chǎn)區(qū)，“河?xùn)|、陜西州郡、杭越”為南五味子產(chǎn)區(qū)，由此可見兩種五味子在產(chǎn)區(qū)分布上存在差異。《本草蒙筌》中記載，“南北各有所長(zhǎng)，藏留切勿相混，風(fēng)寒咳嗽南五味為奇，虛損勞傷北五味最妙”[4];《本草綱目》中記載，“五味，今有南北之分，南產(chǎn)者，色紅;北產(chǎn)者，色黑，入滋補(bǔ)藥必用北產(chǎn)者乃良”[5]。由此可知，南、北五味子在功效、名稱、性狀等方面的記載也不盡相同，其中北五味子質(zhì)量較優(yōu)。

隨著現(xiàn)代研究的深入，南、北五味子藥材間的鑒別技術(shù)不斷優(yōu)化，除常見的性狀、顯微、薄層色譜鑒別等外[6-8]，還有DNA條形碼技術(shù)等鑒定手段[9]。由于南、北五味子藥材產(chǎn)地較多，在現(xiàn)代臨床應(yīng)用中普遍存在混用的現(xiàn)象[10];加之學(xué)者對(duì)兩者的認(rèn)知存在一些偏差，故常將南五味子視為五味子的偽品[11]。因此，如何正確區(qū)分南、北五味子，并對(duì)其進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別并發(fā)掘不同功效的物質(zhì)基礎(chǔ)對(duì)確保臨床療效具有重要的意義。

南、北五味子的化學(xué)成分有所不同，李昕等[12]采用氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）對(duì)南、北五味子揮發(fā)油化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)北五味子中的依蘭烯含量高于南五味子;李曉亮等[13]建立了南、北五味子醇提物的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，并發(fā)現(xiàn)南五味子中五味子酯甲、五味子甲素的含量相對(duì)較高，而北五味子中五味子醇甲的含量相對(duì)較高，但未深入挖掘兩種五味子指紋圖譜中涵蓋的化學(xué)信息，也未篩選出導(dǎo)致南、北五味子差異的標(biāo)志性成分。

中藥化學(xué)成分的復(fù)雜性和多樣性是其發(fā)揮療效的基礎(chǔ)，亦是評(píng)價(jià)藥材質(zhì)量的難點(diǎn)和重點(diǎn)[14]。指紋圖譜可完整、系統(tǒng)地表征藥材樣品中主要化學(xué)成分的相似性特征[15];化學(xué)模式識(shí)別可鑒別藥材樣品間的差異，以綜合評(píng)估中藥質(zhì)量[16-17]?；诖耍狙芯糠謩e建立了南、北五味子藥材的HPLC指紋圖譜，并結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、聚類分析（HCA）、無監(jiān)督模式主成分分析（PCA）、有監(jiān)督模式正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）篩選影響南、北五味子藥材質(zhì)量的差異標(biāo)志物，以期為其質(zhì)量控制及藥效研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC 20AD型HPLC儀（包括二元泵、可制冷自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器、柱溫箱、Labsulotions Version 5.87色譜工作站）、AUW-120D型十萬分之一電子天平均購自日本Shimadzu公司;1260型HPLC儀（包括四元泵、紫外檢測(cè)器、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、Open LABA.01.05色譜工作站）購自美國(guó)Agilent公司;DHG-9070 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）;SB25-12D型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）;5810R型高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）;Milli-Q超純水機(jī)（美國(guó)Millipore公司）;FW-80型微型高速萬能試樣粉碎機(jī)（天津市靜?？h工興電器廠）。

1.2 藥品與試劑

五味子醇甲對(duì)照品（批號(hào)：MUST-19031905，純度：99.46%）、五味子醇乙對(duì)照品（批號(hào)：MUST-19042307，純度：99.88%）、五味子酯甲對(duì)照品（批號(hào)：MUST- 19062302，純度：99.38%）、五味子甲素對(duì)照品（批號(hào)：MUST-19092908，純度：99.35%）均購自成都曼斯特生物科技有限公司;五味子乙素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110765-201512，純度：99.00%）;乙腈為色譜純，甲醇為分析純，水為超純水。

南、北五味子藥材各10批（編號(hào)分別為N1～N10、S1～ S10），分別購自全國(guó)部分連鎖藥店、醫(yī)藥公司及藥材市場(chǎng)，經(jīng)鄭州大學(xué)藥學(xué)院賈陸教授鑒定為木蘭科植物五味子[S. chinensis （Turcz.） Baill.]的干燥成熟果實(shí)、木蘭科植物華中五味子（S. sphenanthera Rehd. et Wils.）的干燥成熟果實(shí)。藥材樣品信息來源見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 南、北五味子HPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Aglient Zobax SB C18（250 mm×4.6 mm，5 ?m）;流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～5 min，51%A;5～20 min，51%A→60%A;20～35 min，60%A;35～40 min，60%A→85%A;40～45 min，85%A;45～48 min，85%A→51%A）;流速：0.8 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：220 nm;柱溫：30 ℃;進(jìn)樣量：5 ?L。

2.1.2 供試品溶液的制備 稱取南、北五味子藥材，粉碎，過三號(hào)篩。精密稱定上述粉末各1.00 g，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：20 kHz）提取20 min，放冷，再次稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，以12 000 r/min離心10 min，取上清液[14]，即得。

2.1.3 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素對(duì)照品4.06、4.02、4.52、4.48、3.74 mg，分別置于2 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻，依次取880、248、40、1 152、336 ?L，置于2 mL量瓶中，混勻，作為混合對(duì)照品母液;精密吸取上述混合對(duì)照品母液適量，加甲醇稀釋，制成上述各成分質(zhì)量濃度分別為133.79、3.75、6.76、193.05、21.79 ?g/mL的混合對(duì)照品溶液。

2.1.4 精密度試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S2）適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。以五味子甲素為參照（S），記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，33個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均不低于0.30%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD均不低于1.33%（n=6），表明方法精密度良好。

2.1.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材樣品粉末（編號(hào)：S2）1.00 g，共6份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以五味子甲素為參照（S），記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，33個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均不低于0.37%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD均不低于2.10%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液（編號(hào)：S2）適量，分別于室溫下放置0、2、4、8、16、24 h時(shí)按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以五味子甲素為參照（S），記錄各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，33個(gè)共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均不低于0.10%（n=6），相對(duì)峰面積的RSD均不低于2.10%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 HPLC指紋圖譜的建立 取南、北五味子藥材樣品各10批，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。將所得色譜數(shù)據(jù)（“AIA”格式）導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，采用中位數(shù)法，設(shè)定時(shí)間窗為0.10 min，經(jīng)多點(diǎn)校正完成匹配后，生成指紋圖譜共有模式，并以此作為對(duì)照指紋圖譜（R）。結(jié)果，北五味子有33個(gè)共有峰，南五味子有32個(gè)共有峰，詳見圖1、圖2。

2.1.8 相似度評(píng)價(jià) 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012版）》，對(duì)南、北五味子藥材樣品的指紋圖譜及其對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果，N1～N10藥材樣品的相似度均大于0.97，相似度良好，表明不同批次南五味子藥材的質(zhì)量較穩(wěn)定;S1～S10藥材樣品的相似度均大于0.99，相似度良好，表明不同批次北五味子藥材的質(zhì)量均一穩(wěn)定，詳見表2。南、北五味子對(duì)照指紋圖譜的相似度為0.50，表明南、北五味子的質(zhì)量存在明顯差異。

2.1.9 共有特征峰的指認(rèn) 根據(jù)南、北五味子藥材的HPLC指紋圖譜生成結(jié)果，選擇圖譜中含量較高且分離度較好的色譜峰作為共有特征峰。結(jié)果，南、北五味子共有19個(gè)共有特征峰，通過與混合對(duì)照品的保留時(shí)間和HPLC色譜圖（見圖3）進(jìn)行對(duì)比，共指認(rèn)出其中的5個(gè)，分別為五味子醇甲（2號(hào)峰）、五味子醇乙（3號(hào)峰）、五味子酯甲（9號(hào)峰）、五味子甲素（13號(hào)峰）、五味子乙素（16號(hào)峰）。因五味子甲素含量相對(duì)較高，分離度較好，且出峰穩(wěn)定，故以其為參照（S）計(jì)算其他共有特征峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。結(jié)果，20批樣品各共有特征峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均不低于0.22%，表明南、北五味子的主要有效成分相似;其相對(duì)峰面積的RSD相差較大（1.26%～140.21%），表明南、北五味子主要有效成分的含量存在差異。

2.2 HCA

采用相似度評(píng)價(jià)雖然能夠很好地反映南、北五味子藥材指紋圖譜的相似程度，但不能體現(xiàn)成分含量的高低，而化學(xué)模式識(shí)別可對(duì)量的差別進(jìn)行分析[18]。HCA是一種通過數(shù)據(jù)建模簡(jiǎn)化多維數(shù)據(jù)，將具有指標(biāo)性的數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類并劃分為相對(duì)同質(zhì)的群組的統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)[19]。以20批南、北五味子的19個(gè)共有特征峰峰面積為變量，借助SPSS 20.0軟件，采用組間聯(lián)接法以歐氏平方距離為區(qū)間進(jìn)行HCA，結(jié)果見圖4。

由圖4可知，南、北五味子20批樣品可聚為兩大類，N1～N10聚為一類，S1～S10聚為一類。其中，N1、N3、N8、N9聚為一類，N2、N4～N7、N10聚為一類;S2、S4、S5、S7、S8、S10聚為一類，S1、S3、S6、S9聚為一類。這提示不同批次五味子藥材樣品質(zhì)量存在差異。

2.3 PCA

PCA可快速表征樣本的差異信息[20]。以19個(gè)共有特征峰的相對(duì)峰面積為變量，采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行PCA，結(jié)果見表3。

2.4 OPLS-DA

以19個(gè)共有特征峰相對(duì)峰面積為多元變量，采用SIMCA 14.1軟件進(jìn)行有監(jiān)督模式的OPLS-DA[22]。結(jié)果，累積解釋能力參數(shù)（R2X）為0.917，累積解釋能力參數(shù)（R2Y）為0.985，預(yù)測(cè)能力參數(shù)（Q2）為0.952，均大于0.5，表明該模型預(yù)測(cè)能力好，可用于區(qū)別南、北五味子藥材，詳見圖6。

為了進(jìn)一步檢驗(yàn)樣本分類是否有效或樣本間是否有差異，提取OPLS-DA模型中的19個(gè)變量，采用SIMCA 14.1軟件對(duì)所建OPLS-DA模型進(jìn)行200次的置換檢驗(yàn)，得到OPLS-DA/S-plot圖，詳見圖7（該圖中，S型曲線上的每個(gè)點(diǎn)各代表1個(gè)化合物，差異性化合物分布在S型曲線的上下端[23]）。

由圖7可知，右上端表示南五味子藥材中峰面積較大的化合物，包括9號(hào)峰（五味子酯甲）和13號(hào)峰（五味子甲素）;左下端表示北五味子藥材中峰面積較大的化合物，分別為2號(hào)峰（五味子醇甲）和16號(hào)峰（五味子乙素）。

變量重要性投影（VIP）可衡量各共有特征峰的表達(dá)模式對(duì)樣本分類判別的影響強(qiáng)度和解釋能力，從而輔助篩選質(zhì)量差異標(biāo)志物[24]。當(dāng)VIP值>1.0時(shí)，表明該變量對(duì)所建模型的貢獻(xiàn)度高于平均水平[25-26]，因此本研究以VIP值>1.0為標(biāo)準(zhǔn)篩選質(zhì)量差異標(biāo)志物。結(jié)果，共得到4個(gè)VIP值大于1的共有特征峰，分別為13號(hào)峰（五味子甲素，VIP值為2.29）、2號(hào)峰（五味子醇甲，VIP值為2.24）、9號(hào)峰（五味子酯甲，VIP值為1.73）和16號(hào)峰（五味子乙素，VIP值為1.48）。這提示上述4個(gè)成分為影響南、北五味子藥材質(zhì)量的差異標(biāo)志性成分，詳見圖8。

3 討論

本研究試驗(yàn)前期采用二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行了190～800 nm全波長(zhǎng)掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在220 nm波長(zhǎng)處所得指紋圖譜的色譜峰信息較為全面，可識(shí)別的化合物種類也較豐富，故選擇220 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。隨后，對(duì)乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-水等不同流動(dòng)相體系的分離效果進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，各色譜峰的峰形佳且流動(dòng)相配制簡(jiǎn)單，故選擇乙腈-水為流動(dòng)相。同時(shí)，又考察了不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)流速為0.8 mL/min時(shí)，色譜峰峰形和分離度均較好，故選擇流速為0.8 mL/min。

本研究采用HPLC法分別建立了南、北五味子藥材的指紋圖譜。結(jié)果顯示，南、北五味子指紋圖譜中分別有32、33個(gè)共有峰。選擇指紋圖譜中含量較高且分離度較好的色譜峰作為共有特征峰，共標(biāo)定出19個(gè)共有特征峰;通過與混合對(duì)照品指認(rèn)，共鑒別出其中的5個(gè)，分別為五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素。

本研究采用HCA、PCA法對(duì)南、北五味子藥材進(jìn)行分類。結(jié)果顯示，20批樣品可聚為兩類，N1～N10聚為一類，S1～S10聚為一類。其中，N1、N3、N8、N9聚為一類，N2、N4～N7、N10聚為一類;S2、S4、S5、S7、S8、S10聚為一類，S1、S3、S6、S9聚為一類。PCA結(jié)果與HCA結(jié)果一致。為進(jìn)一步表征兩者的差異，本研究采用OPLS-DA法共篩選出了4個(gè)影響南、北五味子藥材質(zhì)量的差異標(biāo)志物，分別為五味子甲素、五味子醇甲、五味子酯甲、五味子乙素。

綜上所述，所建HPLC指紋圖譜準(zhǔn)確、科學(xué)、簡(jiǎn)便易行，結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析可用于評(píng)價(jià)南、北五味子藥材的質(zhì)量。兩種藥材質(zhì)量的差異標(biāo)志物為五味子甲素等4種成分。

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（收稿日期：2020-05-11 修回日期：2020-07-06）

（編輯：陳 宏）