P38有絲分裂原活化蛋白激酶在煙霧暴露大鼠肺血管重塑中的作用

馬海麗 彭紅星 曾玉蘭 江雅婷 周月泉

肺血管重塑在慢性阻塞性肺疾病和肺源性心臟病過程中起關鍵作用，吸煙、炎癥、低氧等均可誘導肺血管重塑[1]，其中長期煙霧暴露可引起肺血管平滑肌細胞的異常增殖，促使肺肌型動脈增加、肺小動脈結構改變[2]，是引起肺血管重塑的一項獨立危險因素。有研究表明，煙霧暴露可促使P38有絲分裂原活化蛋白激酶(P38MAPK)的活化增加，激活一系列炎癥和細胞因子，在慢性阻塞性肺疾病的氣道炎癥及氣道重塑病理過程中發(fā)揮重要作用。本研究通過制備煙霧暴露大鼠模型，觀察不同時間段P38MAPK的表達水平及肺血管重塑情況，以及加入P38MAPK抑制劑后P38MAPK表達水平及肺血管重塑的變化，探討P38MAPK信號通路與煙霧暴露大鼠肺血管重塑的關系。

材料與方法

1.材料：SD雄性大鼠50只，體質量為200～220 g，飼養(yǎng)于華中科技大學同濟醫(yī)學院動物中心。兔抗P38MAPK多克隆抗體購于愛必信(上海)生物科技有限公司，P38MAPK特異性抑制劑SB203580(美國Selleck公司)、小鼠抗α-平滑肌肌動蛋白(SMA)單克隆抗體、DAB顯色試劑盒均購于武漢谷歌生物公司，Mix試劑盒和逆轉錄試劑盒購于康為世紀公司，P38MAPK、GAPDH引物由天一輝遠公司合成。

2.方法

(1)動物模型制備及分組：制備煙熏箱(110 cm×75 cm×50 cm)，每5支香煙捆扎點燃后放入煙熏箱，將大鼠分別裝入小鋼絲籠中，置于煙熏箱內被迫吸入煙霧，使用CY-12C數字測氧儀監(jiān)測煙熏箱中的氧濃度，使煙熏箱中的氧濃度保持在20%～21%[3]。將SD大鼠隨機分為5組：對照組(C組)、煙霧暴露4周組(S4組)、煙霧暴露12周組(S12組)、SB203580干預4周組(SB4組)、SB203580干預12周組(SB12組)，每組各10只。C組大鼠在常規(guī)無煙環(huán)境中喂養(yǎng)；煙霧暴露各組大鼠放入煙熏箱中，每天煙霧暴露2次，2次暴露時間間隔>4 h；SB203580干預各組：前期制備同煙霧暴露組，每次吸煙前予每只大鼠腹腔注射5 mg/kg SB203580。SB203580以二甲基亞砜(DMSO)溶解，使用前以生理鹽水稀釋，使DMSO的終濃度為2%，SB203580的最終濃度為5 mg/ml。C組大鼠分別于第4、12周各處死5只，S4組和SB4組大鼠均于第4周處死，S12組和SB12組大鼠均于第12周處死。

(2)病理標本制作：各組造模完成后麻醉后處死大鼠，分離肺臟和右肺動脈，右肺動脈置于-80 ℃冰箱保存供逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)用。左肺放入4%的中性甲醛固定，脫水、石蠟包埋，用于蘇木素-伊紅(HE)染色和免疫組化。

(3)肺組織HE染色和病理形態(tài)觀察：石蠟包埋切片后對肺組織進行HE染色，觀察各組大鼠肺組織及肺血管的病理學改變。每張切片隨機選取結構完整、斷面直徑為50～200 μm的肺動脈5支，采用HMIAS-2000彩色圖文分析系統(tǒng)進行測量分析，測量血管的內外徑，計算血管壁厚度、血管壁面積、血管總面積及血管重塑指標[血管壁面積/血管總面積(WA)及血管壁厚度/血管外徑(WT)]。

(4)免疫組化法檢測肺動脈α-SMA和肺動脈P38MAPK蛋白的表達水平：石蠟切片脫蠟水化，磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗2次，每次5 min，3%過氧化氫孵育10 min，PBS沖洗2次，每次5 min，枸櫞酸鈉緩沖液抗原修復后，滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20 min，分別加入小鼠抗α-SMA單克隆抗體和兔抗P38MAPK多克隆抗體，4 ℃過夜，加入DAB試劑盒顯色，脫水、透明、封片后，在顯微鏡下隨機選取每張切片上肺動脈采集圖像，采用HMIAS-2000圖文分析系統(tǒng)進行定量分析。

(5)RT-PCR檢測肺動脈P38MAPK mRNA的表達水平：將保存于-80 ℃冰箱中的肺動脈組織加入TRIzon試劑，按照試劑盒說明書提取肺動脈總RNA，取3 μg RNA進行逆轉錄合成cDNA,然后取1 μl cDNA進行PCR擴增，設計特異性引物，反應在25 μl體系中進行,反應條件為95 ℃ 5 min,95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40個循環(huán)。由BioRad軟件分析計算各組Ct值，以2-△△ct表示P38MAPK mRNA表達水平。PCR引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

結 果

1.5組大鼠肺動脈HE染色結果比較：C組大鼠肺動脈管壁較薄、光滑，平滑肌細胞排列規(guī)則，可見少量炎癥細胞；煙霧暴露組大鼠肺動脈管壁可見不同程度增生，管壁周圍較多炎癥細胞浸潤，隨著暴露時間逐漸延長，管壁增生逐漸明顯；與煙霧暴露各組比較，P38MAPK抑制劑干預各組大鼠肺動脈管壁增生減弱，炎癥細胞浸潤明顯減少。見圖1。S4組、S12組大鼠肺動脈WA和WT均高于C組，S12組大鼠肺動脈WA和WT均高于S4組，SB4組大鼠肺動脈WA和WT均低于S4組，SB12組大鼠肺動脈WA和WT均低于S12組(P<0.05)。見表2。

圖1 5組大鼠肺動脈HE染色結果比較(A：C組；B：S4組；C：S12組；D：SB4組；E：SB12組；HE染色，×400)

圖2 5組大鼠肺動脈α-SMA的表達水平比較(A：C組；B：S4組；C：S12組；D：SB4組；E：SB12組；免疫組化染色，×200)

圖3 5組大鼠肺動脈P38MAPK蛋白的表達水平比較(A：C組；B：S4組；C：S12組；D：SB4組；E：SB12組；免疫組化染色，×200)

表2 5組大鼠肺血管重塑指標比較

2.5組大鼠肺動脈α-SMA的表達水平比較：C組、S4組、S12組、SB4組、SB12組大鼠肺動脈α-SMA的表達水平分別為0.10±0.01、0.16±0.01、0.29±0.02、0.09±0.01及0.17±0.02，其中S4組和S12組高于C組，S12組高于S4組，SB4組低于S4組，SB12組低于S12組(P<0.05)。見圖2。

3.5組大鼠肺動脈P38MAPK蛋白和mRNA的表達水平比較：胞質呈棕黃色染色為P38MAPK蛋白陽性表達。S4組、S12組大鼠肺動脈P38MAPK蛋白和mRNA的表達水平均高于C組，S12組大鼠肺動脈P38MAPK蛋白和mRNA的表達水平均高于S4組，SB4組大鼠肺動脈P38MAPK蛋白和mRNA的表達水平均低于S4組，SB12組大鼠肺動脈P38MAPK蛋白和mRNA的表達水平均低于S12組(P<0.05)。見圖3和表3。

表3 5組大鼠肺動脈P38MAPK蛋白和mRNA表達水平比較

討 論

研究發(fā)現，香煙煙霧可直接作用于肺血管系統(tǒng)，進而引起一系列病理生理改變。香煙煙霧提取物可引起COPD患者早期肺血管改變，甚至在無氣流受限的吸煙者中即已出現肺血管改變，與非吸煙者比較，吸煙者的肺血管厚度明顯增加[4]。本研究通過建立煙霧暴露大鼠模型，發(fā)現其存在不同程度的肺泡結構破環(huán)，肺血管的管壁增厚，管腔變窄，肺動脈WA和WT高于C組，隨著煙霧暴露時間的延長，WA和WT均逐漸增加，肺動脈壁逐漸增厚，周圍炎癥細胞浸潤逐漸明顯，S12組大鼠的肺動脈管壁增厚、管腔狹窄最明顯。α-SMA主要表達于肺平滑肌細胞和成纖維細胞中，可間接反映肺血管重塑及肺小動脈肌化[5]。本研究結果顯示，煙霧暴露各組大鼠肺動脈α-SMA的表達水平均高于C組，且與煙霧暴露時間呈正比，表明香煙煙霧可直接引起肺血管重塑，肺血管重塑的程度隨著暴露時間延長逐漸增加。

煙霧暴露可通過激活多種炎癥因子參與肺血管重塑過程[6]。P38MAPK信號通路是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)介導細胞反應通路的重要分支，P38MAPK活化后作用于下游的激酶、細胞因子等，產生多種效應，在體內作用廣泛[7]。煙霧暴露可激活中性粒細胞、肺泡巨噬細胞等炎癥細胞，促進多種細胞因子的表達，如腫瘤壞死因子(TNF)-α、巨噬細胞炎性蛋白(MIP)-2、基質金屬蛋白酶(MMP)-12等，活化P38MAPK,上調P38MAPK的表達[8]。本研究結果顯示，P38MAPK蛋白在C組大鼠肺動脈中存在少量表達，而煙霧暴露刺激后P38MAPK蛋白的表達明顯增加，且隨著時間的延長，P38MAPK蛋白的表達水平逐漸增加。此外，與C組比較，煙霧暴露各組大鼠P38MAPK mRNA的表達水平上調，且P38MAPK mRNA的表達與暴露時間呈正比，推測P38MAPK可能參與了煙霧暴露引起的肺血管重塑過程。既往研究結果顯示，肺血管重塑可能與肺動脈平滑肌細胞的增殖分化有關，MAPK信號通路可能參與肺平滑肌細胞的增殖和凋亡的調控，進而引起肺血管重塑[9]。程振玲[10]在低氧引起肺動脈高壓模型中也發(fā)現了P38MAPK的表達增加。有研究結果發(fā)現，相對于非肺動脈高壓，肺動脈高壓患者中活化P38MAPK的表達水平明顯升高，P38MAPK信號通路激活可引起肺血管平滑肌細胞異常增殖，最終導致肺動脈高壓[11]。

SB203580作為P38MAPK抑制劑的一種，可抑制P38MAPK信號通路介導的細胞反應。有研究結果發(fā)現，P38MAPK抑制劑可逆轉低氧引起的肺血管重塑，通過抑制P38MAPK信號通路，減輕炎癥因子釋放，進而逆轉肺動脈高壓[12-13]，抑制肺動脈收縮[14]。本研究結果顯示，與煙霧暴露組比較，加入P38MAPK抑制劑后，大鼠肺動脈管壁變薄，管壁增生減弱，炎癥細胞浸潤減輕，肺血管重塑指標WA和WT及α-SMA的表達水平均降低，提示肺小動脈肌化程度下降。同時，肺動脈P38MAPK蛋白和mRNA的表達明顯受到抑制，表明通過抑制P38MAPK下調P38MAPK的表達，可減緩肺血管重塑的程度，提示P38MAPK可能是引起肺血管異常增生的重要因子之一。但本研究未進一步探討該通路下游因子的表達，尚存在一定的不足。

綜上所述，煙霧暴露可能通過上調P38MAPK的表達引起肺血管平滑肌增生，進而引起肺血管重塑，P38MAPK抑制劑可降低P38MAPK的表達，減輕肺血管重塑，提示P38MAPK可能參與了吸煙引起的肺血管重塑。但對于P38MAPK信號通路及其P38MAPK抑制劑的作用機制尚需進一步研究。