海南植煙區(qū)煙田煙粉虱隱種分布和系統(tǒng)發(fā)育分析

李 萌，夏長(zhǎng)劍，邵 雨，薛國(guó)喜，賀 遠(yuǎn)，王天玉，呂洪坤，陳德鑫*

1. 鄭州輕工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，鄭州高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)科學(xué)大道136 號(hào) 450001 2. 中國(guó)煙草總公司海南省公司?？谘┣蜒芯克?，?？谑屑t城湖路22 號(hào) 571100 3. 海南省煙草公司儋州市公司，海南省儋州市那大鎮(zhèn)中興街中段 571700

煙粉虱（Bemisia tabaci）是我國(guó)煙草上的重要害蟲(chóng)，主要以刺吸植物汁液、分泌蜜露誘發(fā)煤污病及傳播煙草曲葉病毒?。═obacco leaf curl disease，TLCD）3 種方式為害煙草，尤其以傳播曲葉病毒病造成的損失最為嚴(yán)重［1-4］。煙粉虱的分類(lèi)地位一直存在爭(zhēng)議，目前普遍認(rèn)為煙粉虱在形態(tài)上很難區(qū)分，但在抗藥性、寄主適應(yīng)性及傳毒效率等生物學(xué)特性上存在明顯差異，是多個(gè)隱種構(gòu)成的復(fù)合種［5］。臧連生等［6］研究發(fā)現(xiàn)入侵的煙粉虱隱種MEAM1 對(duì)吡蟲(chóng)啉和吡丙醚的敏感性均低于土著煙粉虱隱種Asia II 3。Jiu 等［7］比較了入侵和土著煙粉虱在煙草（品種為NC89）上的生殖力和壽命，發(fā)現(xiàn)入侵煙粉虱隱種MEAM1 在煙草上的壽命和產(chǎn)卵量均顯著高于土著煙粉虱隱種Asia II 3。Liu等［8］發(fā)現(xiàn)入侵煙粉虱隱種MEAM1 可高效傳播煙草曲葉病毒病病原中國(guó)番茄黃化曲葉病毒，而入侵煙粉虱隱種MED 卻不能傳播該病毒。由于不同煙粉虱隱種在重要生物學(xué)特性上差異顯著，煙粉虱隱種類(lèi)型的準(zhǔn)確鑒定已成為制定有效防治技術(shù)的基本前提。盡管已有許多研究報(bào)道了煙粉虱對(duì)煙草的為害［9-12］，但對(duì)煙田煙粉虱隱種進(jìn)行鑒定的報(bào)道卻不多。饒瓊等［13］報(bào)道湖北武漢煙草上發(fā)生的煙粉虱隱種為MEAM1；趙瑞華等［14］報(bào)道陜西延安煙草上發(fā)生的煙粉虱隱種為MEAM1 和MED；Jiu 等［15］報(bào)道河南許昌煙草上發(fā)生的煙粉虱隱種為MED。海南是我國(guó)雪茄煙葉的主要產(chǎn)區(qū)和重要的煙草南繁育種基地，由于以往煙草栽培面積有限，海南煙草病蟲(chóng)害的普查工作較為滯后，海南煙草上煙粉虱危害狀況的研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道，其隱種類(lèi)型也不清楚。因此，為明確海南煙草上煙粉虱的發(fā)生狀況和隱種分布，調(diào)查了海南省主要植煙區(qū)煙田煙粉虱及其傳播曲葉病毒病的發(fā)生程度，并應(yīng)用線粒體COI基因PCR-RFLP 和系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)煙粉虱隱種類(lèi)型進(jìn)行了鑒定，旨在為了解海南煙草上煙粉虱隱種多樣性及對(duì)煙粉虱進(jìn)行綜合治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 材料從海南省儋州、屯昌和澄邁的雪茄煙田及三亞、樂(lè)東煙草南繁育種基地采集的煙粉虱樣品。

1.1.2 試劑

2×Taq Plus Master Mix 購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司；DNA 聚合酶、Taq I 內(nèi)切酶、蛋白酶K、帕拉膜和瓊脂糖等購(gòu)自生工生物工程（上海）有限公司；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.3 儀器

Vetiti 型 梯 度PCR 儀（美 國(guó)ABI 公 司）；DYY-6C 型電泳儀（北京市六一儀器廠）；Mini Bis Pro 型凝膠成像分析系統(tǒng)（以色列DNR 凝膠成像系統(tǒng)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 田間調(diào)查和樣品采集

在每塊煙田以“Z”字形選取5 個(gè)調(diào)查點(diǎn)（每點(diǎn)50 株），于2019 年2～4 月調(diào)查整株煙草上的煙粉虱成蟲(chóng)數(shù)量和煙草曲葉病毒病發(fā)病株數(shù)，計(jì)算發(fā)病率。調(diào)查過(guò)程中用裝有無(wú)水乙醇的1.5 mL 離心管隨機(jī)采集活體煙粉虱成蟲(chóng)30～50 頭。采集的煙粉虱樣品于-20 ℃保存。

1.2.2 煙粉虱基因組DNA 提取

用移液器把單頭煙粉虱從無(wú)水乙醇中吸至剪成小片的帕拉膜上，待酒精揮發(fā)后滴加15μL 裂解液（10 mmol/L Tris，pH 8.4；50 mmol/L KCl，0.45%Tween-20，0.2%Gelatin，0.45%NP40，100μg/mL 蛋白酶K），用0.2 mL 離心管底部充分研磨蟲(chóng)體，將勻漿液吸入0.2 mL 離心管中。吸取10μL 裂解液清洗帕拉膜上的研磨煙粉虱處數(shù)次，將清洗液與勻漿液合并。將含煙粉虱提取液的0.2 mL 離心管置入PCR 儀中65 ℃孵育30 min，然后95 ℃10 min滅活蛋白酶K 即完成煙粉虱基因組DNA 提取。提取的煙粉虱基因組DNA 于-20 ℃儲(chǔ)存。

1.2.3 線粒體COI基因PCR-RFLP 鑒定

每個(gè)采樣點(diǎn)隨機(jī)挑選30 頭煙粉虱，參考秦麗等［16］描述的線粒體COI基因PCR-RFLP 技術(shù)鑒定煙粉虱隱種。以煙粉虱基因組DNA 為模板，應(yīng)用通用引物C1-J-2195（5'-TTGATTTTTTGGTCATCC AGAAGT-3'）和TL2-N-3014（5'-TCCAATGCACTA ATCTGCCAT ATTA-3'）擴(kuò)增煙粉虱線粒體COI基因片段（866 bp）。PCR 反應(yīng)體系（20μL）為：煙粉虱基因組DNA 2μL，2×Taq Plus Master Mix 10μL，10μmol/L 上下游引物各0.5μL，ddH2O 7μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性1.5 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。取PCR 產(chǎn)物進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系（10 μL）為：10×Buffer 1 μL，Taq I內(nèi)切酶（10 U）1 μL，PCR產(chǎn)物7 μL，ddH2O 1 μL，酶切反應(yīng)條件為65 ℃1 h。酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳（85 V，40 min）后在凝膠成像系統(tǒng)上拍照，參照煙粉虱隱種標(biāo)準(zhǔn)圖譜鑒定煙粉虱隱種［16］。

1.2.4 線粒體COI基因測(cè)序與序列分析

線粒體COI基因通過(guò)PCR-RFLP 隱種鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖1。每個(gè)采集點(diǎn)選擇2～3 個(gè)具有代表性線粒體COI基因PCR-RFLP 譜帶的樣本，應(yīng)用1.2.3 節(jié)描述方法再次擴(kuò)增其線粒體COI基因片段。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送尚亞生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果保存于Genbank（表1）中。應(yīng)用MEGA 6.0 的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并分析海南煙草上煙粉虱隱種和中國(guó)境內(nèi)已知的14 種煙粉虱隱種線粒體COI基因的遺傳距離和親緣關(guān)系。

圖1 海南澄邁煙粉虱線粒體COI 基因PCR 產(chǎn)物Taq I 酶切圖譜Fig.1 PCR products of mitochondrial COI of Bemisia tabaci in Chengmai，Hainan after digested by Taq I

2 結(jié)果與分析

2.1 煙粉虱及其傳播的煙草曲葉病毒病的發(fā)生概況

在儋州、屯昌、五指山和澄邁4 個(gè)雪茄煙調(diào)查點(diǎn)及三亞、樂(lè)東2 個(gè)烤煙繁種調(diào)查點(diǎn)調(diào)查了煙粉虱及其傳播的曲葉病毒病發(fā)生和為害狀況，調(diào)查結(jié)果（表2）顯示，除五指山調(diào)查點(diǎn)外，其他調(diào)查煙田均發(fā)現(xiàn)煙粉虱為害，為害部位主要集中在中下部葉片。澄邁煙粉虱蟲(chóng)株率較低（35%），其蟲(chóng)口密度也最低（0.5 頭/株）；儋州、屯昌、三亞和樂(lè)東煙粉虱蟲(chóng)株率均大于80%，蟲(chóng)口密度為5～10 頭/株。除五指山外，所有發(fā)現(xiàn)煙粉虱的煙田均發(fā)現(xiàn)了感染煙草曲葉病毒的煙株，病株率為1%～3%，發(fā)病植株嚴(yán)重矮化、葉片扭曲，基本喪失經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

表1 序列分析所用線粒體COI 基因序列Tab.1 Mitochondrial COI gene sequences used for sequence analysis

表2 煙粉虱及其傳播曲葉病毒病田間調(diào)查結(jié)果Tab.2 Occurrences of Bemisia tabaci and tobacco leaf curl disease spread by B. tabaci in tobacco fields

2.2 線粒體COI 基因PCR-RFLP 鑒定煙粉虱隱種

5 個(gè)采集點(diǎn)共計(jì)150 頭煙粉虱的線粒體COI基因的TaqⅠ酶切圖譜呈現(xiàn)兩種類(lèi)型（圖1），與秦麗等［16］報(bào)道的煙粉虱MEAM1 隱種和MED 隱種的線粒體COI基因PCR-RFLP 圖譜一致，初步表明海南煙草上發(fā)生的煙粉虱是入侵煙粉虱MEAM1 隱種和MED 隱種。

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

應(yīng)用海南12 個(gè)煙粉虱和中國(guó)境內(nèi)已報(bào)道煙粉虱隱種線粒體COI基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)顯示，海南煙田煙粉虱形成了兩個(gè)分支，分別與入侵煙粉虱隱種MEAM1 隱種和MED 隱種聚為一支，表明海南煙田發(fā)生的煙粉虱為MEAM1 隱種和MED 隱種（圖2）。多重序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，海南MEAM1 隱種和MED 隱種的序列相似度為94%，不同地區(qū)MEAM1 隱種間的序列相似度為100%，不同地區(qū)MED 隱種間的序列相似度均大于99%，見(jiàn)表3。

圖2 基于線粒體COI 基因構(gòu)建的煙粉虱隱種系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of Bemisia tabaci cryptic species generated by analysis of mitochondrial COI sequences

表3 海南植煙區(qū)煙田煙粉虱隱種線粒體COI 基因序列相似度分析Tab.3 Similarity between mitochondrial COI sequences of Bemisia tabaci collected from different tobacco-growing areas in Hainan （%）

2.4 海南植煙區(qū)煙田煙粉虱種群分布

不同采集點(diǎn)煙粉虱隱種鑒定結(jié)果如表4 所示。海南儋州、屯昌和樂(lè)東煙田煙粉虱種群為MEAM1隱種；澄邁和三亞煙田為MEAM1 和MED 混合發(fā)生，MEAM1 所占比例分別為56.7%和83.3%?？傮w來(lái)看，海南煙草上發(fā)生的煙粉虱是入侵隱種MEAM1和MED，其中MEAM1為優(yōu)勢(shì)隱種。

表4 海南植煙區(qū)煙粉虱隱種構(gòu)成Tab.4 Cryptic species composition of Bemsia tabacci in different tobacco-growing areas in Hainan

3 討論

煙粉虱MEAM1 和MED 隱種是世界性重要入侵有害生物，主要為害葫蘆科、茄科和十字花科蔬果及花卉、棉花、煙草等經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的作物［17］。海南早在2002 年就有MEAM1 隱種發(fā)生為害的報(bào)道［18］。海南已報(bào)道的煙粉虱隱種包括入侵隱種MEAM1 和MED 及Asia I 、Asia II 1 和China 1 3 個(gè)土著隱種［19］。與郭磊等［20］2017 年對(duì)海南三亞、澄邁和陵水茄科蔬菜和瓜類(lèi)上煙粉虱的隱種鑒定結(jié)果類(lèi)似，本研究中發(fā)現(xiàn)海南主要植煙區(qū)煙草上的煙粉虱為入侵隱種MEAM1 和MED，未發(fā)現(xiàn)土著煙粉虱，表明海南省田間發(fā)生為害的煙粉虱均為入侵煙粉虱隱種，土著煙粉虱隱種可能已被入侵煙粉虱隱種所取代。海南不同植煙區(qū)煙粉虱的隱種構(gòu)成存在一定差異，儋州、屯昌和樂(lè)東煙田煙粉虱種群為MEAM1 隱種，而澄邁和三亞煙田則為MEAM1 和MED 混合發(fā)生。由于海南植煙歷史較短且多與蔬果產(chǎn)區(qū)重疊，推測(cè)這些差異可能與煙田周邊其他作物上的遷入蟲(chóng)源的隱種構(gòu)成有關(guān)。綜合來(lái)看，海南主要植煙區(qū)煙草上的煙粉虱的優(yōu)勢(shì)隱種為MEAM1，有取代MED 隱種成為唯一隱種的趨勢(shì)。

本研究中還發(fā)現(xiàn)煙粉虱在海南植煙區(qū)煙草上發(fā)生普遍，但蟲(chóng)口密度相對(duì)較低，并未對(duì)煙株生長(zhǎng)發(fā)育造成可見(jiàn)為害，整體為害程度較輕。入侵煙粉虱隱種MEAM1 和MED 的寄主范圍很廣，但其對(duì)不同寄主或同一寄主植物的不同品種的適應(yīng)性存在明顯差異［12，21］。田間調(diào)查發(fā)現(xiàn)，煙粉虱在雪茄煙煙株上的偽蛹和若蟲(chóng)數(shù)量均較少，表明栽培的雪茄煙品種可能對(duì)煙粉虱的適合性不高。此外，本研究中調(diào)查的煙田周邊均距蔬菜田較遠(yuǎn)或有林木隔離，致使蟲(chóng)源遷入較少，這也可能是煙草上蟲(chóng)口密度較低的原因。盡管煙粉虱造成的直接為害并不嚴(yán)重，但有煙粉虱分布的煙田均發(fā)現(xiàn)了煙草曲葉病毒病病株，個(gè)別地塊病株率高達(dá)5%，發(fā)病煙株基本失去經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由于煙粉虱對(duì)煙草曲葉病毒病病原的傳播效率較高且可終身攜毒［22］，因此，煙葉生產(chǎn)上仍需重視對(duì)媒介昆蟲(chóng)煙粉虱的防治。

4 結(jié)論

對(duì)海南植煙區(qū)煙粉虱發(fā)生情況進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，煙粉虱在海南植煙區(qū)普遍發(fā)生，整體為害程度較輕，但其傳播的煙草曲葉病毒病在部分植煙區(qū)發(fā)生較為嚴(yán)重。應(yīng)用線粒體COI基因PCR-RFLP和系統(tǒng)發(fā)育分析對(duì)不同植煙區(qū)煙田煙粉虱隱種進(jìn)行了鑒定，結(jié)果顯示海南煙草上發(fā)生的煙粉虱是入侵隱種MEAM1 和MED，其中MEAM1 為優(yōu)勢(shì)隱種。