槐糖脂發(fā)酵液預(yù)處理及不同結(jié)構(gòu)槐糖脂的分離純化

張慧敏，周如國，2，于澤權(quán)，馬曉靜，2，姚日生

（1 合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥230009；2 悅康藥業(yè)集團安徽生物制藥有限責(zé)任公司，安徽阜陽236033）

近年來，生物表面活性劑[1]由于具有表面/界面活性好、選擇性高、環(huán)境友好[2]、良好的抑菌作用等特點被人們關(guān)注，根據(jù)親水部分的結(jié)構(gòu)不同，主要可分為糖脂類、脂肪酸類、脂肽類和聚合表面活性劑。其中，糖脂類生物表面活性劑由于其高產(chǎn)量得到廣泛研究，具有乳化、分散、增溶、發(fā)泡、滲透、潤濕等功能[3]?；碧侵琜4]是一類目前產(chǎn)量最高的糖脂類生物表面活性劑，主要是由球擬假絲酵母（Starmerella bombicola）等經(jīng)過發(fā)酵獲得的次級代謝產(chǎn)物，除具有優(yōu)良的表面/界面活性、乳化/分散活性外，還具有無毒或低毒，生物可降解，不致敏、可消化，生物可再生[5]，環(huán)境兼容性好，結(jié)構(gòu)多樣，抗菌、抗病毒、抗腫瘤[6]等藥理作用和免疫功能等優(yōu)點。因此，槐糖脂在醫(yī)藥工業(yè)、環(huán)境保護、日化工業(yè)、石油工業(yè)、農(nóng)業(yè)及納米科技等領(lǐng)域有著巨大的開發(fā)潛力和應(yīng)用前景。王曉峰等[7]選用陰離子型表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉與內(nèi)酯型槐糖脂復(fù)配，并使用硅酸鈉作為助劑修復(fù)石油污染土壤，三者間的復(fù)配使得洗脫率達(dá)到了87.37%；陳靜等[8]發(fā)現(xiàn)當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到1mg/mL時，槐糖脂對大腸桿菌的抑制率可達(dá)87%，對枯草芽孢桿菌的抑制率可達(dá)91%。除科學(xué)研究，關(guān)于槐糖脂的應(yīng)用研究也已經(jīng)趨于成熟，初步進入了工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用推廣階段。國外Saraya、Soliance、Allied Carbon Solutions Ltd.、 DSM Nutritional Products、 Ecover Belgium等大型公司已將槐糖脂應(yīng)用于食品、藥品、殺菌劑、洗滌劑、化妝品和采油等領(lǐng)域[9]。

微生物天然合成的槐糖脂是由一系列結(jié)構(gòu)類似物組成的混合物，主要分為酸型和內(nèi)酯型兩大類，可選擇性地用于不同領(lǐng)域。一般來說，內(nèi)酯型槐糖脂具有較高的親脂性，可降低液體表面張力，其抑菌、抗癌等活性較高；酸型槐糖脂具有更好的水溶性和發(fā)泡能力，是優(yōu)良的發(fā)泡劑[10]。而天然獲得的槐糖脂通常為混合物，往往存在以下缺陷：以不同底物發(fā)酵合成的內(nèi)酯型與酸型槐糖脂的產(chǎn)量和比例會出現(xiàn)不同[11]，導(dǎo)致不同廠家或同一廠家不同批次的產(chǎn)物均一性無法保證，從而在應(yīng)用中難以確定槐糖脂用量，或產(chǎn)生使用效果出現(xiàn)偏差的問題。內(nèi)酯型槐糖脂與酸型槐糖脂因結(jié)構(gòu)不同而導(dǎo)致理化特性及生物活性不同，因此可發(fā)揮不同的作用，若以混合物的形式發(fā)揮其中某一類成分的作用，則浪費另一類成分的槐糖脂。在科學(xué)研究中，若以混合物形式探索槐糖脂的性質(zhì)，則難以確定真正發(fā)揮效用的部分，結(jié)合槐糖脂混合物中兩類槐糖脂的產(chǎn)量和比例常常不同的問題，可能會出現(xiàn)實驗結(jié)果難以重現(xiàn)，無法進行進一步的研究。因此，若要充分發(fā)揮槐糖脂的特性，更好地將其應(yīng)用于各個領(lǐng)域，提高每類組分的利用率，必須將二者分離。實驗室水平主要通過有機試劑萃取法和離心法[4,9]對兩類槐糖脂進行分離純化。

目前，槐糖脂的應(yīng)用研究[12]在不斷發(fā)展，槐糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)和應(yīng)用前景十分廣闊。但是與實驗室水平不同的是，在工業(yè)化生產(chǎn)中，微生物的生長、發(fā)酵過程以及產(chǎn)物的分離純化方法由于尺度效應(yīng)會有所改變，所以傳統(tǒng)的有機溶劑法和離心法已不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。此外，考慮到環(huán)保、健康和安全分析，有機溶劑萃取法需使用大量有機試劑，高速離心會產(chǎn)生大量能耗和巨額前期投入，因此傳統(tǒng)的工藝也需要升級和改進。

基于以上原因，本文考察和論證了利用已經(jīng)成熟且工業(yè)化應(yīng)用的樹脂分離技術(shù)[13]、膜分離技術(shù)[14]及超濾-濃縮技術(shù)[15]用于槐糖脂分離、純化及濃縮的可行性。利用自然沉降法替代傳統(tǒng)乙酸乙酯萃取法獲得內(nèi)酯型槐糖脂，利用板框過濾替代傳統(tǒng)實驗室離心法去除菌絲體，利用樹脂吸附及超濾法除雜替代實驗室及生產(chǎn)中常用的有機溶劑萃取法及醇沉法，通過板框過濾-樹脂吸附-超濾納濾濃縮法獲得高純度的酸型槐糖脂產(chǎn)品。該預(yù)處理及分離純化工藝可以獲得高純度的內(nèi)酯型槐糖脂與酸型槐糖脂，填補了市售產(chǎn)品均為兩者混合物的缺陷，還可以減少有機試劑的使用量，提高槐糖脂生產(chǎn)的安全性與可行性。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

槐糖脂發(fā)酵液，某公司市售槐糖脂（總含量50g/L），pH 計，EC-214 電導(dǎo)率儀，數(shù)顯恒溫水浴鍋，UV-752 型紫外可見分光光度計，不同樹脂柱（100cm×12cm，填料1L），R-201 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，冷凍離心機（Eppendorf，德國），膜分離中試裝置[HF-C-S-9X1-01型，凱能高科技工程（上海）有限公司生產(chǎn)]，Agilent 1100 series HPLC 分析系統(tǒng)（Shimadzu，日本）等。

1.2 處理及檢測方法

1.2.1 發(fā)酵液的預(yù)處理

發(fā)酵結(jié)束后，升溫至50℃滅菌處理40min，自然降溫1.5h，同時關(guān)閉攪拌和降低空氣流量，將發(fā)酵液收集到細(xì)長形圓柱狀的容器中，下接高30cm、直徑2.5cm 的細(xì)長玻璃柱，靜置20min 后收集下層黏稠狀內(nèi)酯型槐糖脂。取上層發(fā)酵液，向其中加入硅藻土[16-17]，進行板框過濾、循環(huán)過濾直到濁度穩(wěn)定，隨后進行樹脂處理。

（1）助濾劑硅藻土添加量的選擇 向上層發(fā)酵液中分別添加不同量的硅藻土，使其添加量分別為0、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，進行板框過濾，以發(fā)酵液濁度、槐糖脂回收率及發(fā)酵液蛋白含量為評價指標(biāo)確定助濾劑硅藻土的添加量。

（2）板框過濾濾布層數(shù)的選擇 確定硅藻土添加量后，考察1～6層濾布對過濾效果的影響。將工廠現(xiàn)有的滌綸材質(zhì)濾布裁剪成尺寸為0.3m×0.3m的方形，按照要求提前安裝在板框上，將發(fā)酵液分成6 個批次，每次過濾后清洗設(shè)備，更換新的濾布。以槐糖脂回收率、發(fā)酵液濁度、蛋白含量為評價指標(biāo)確定濾布層數(shù)。

1.2.2 樹脂的預(yù)處理

（1）離子交換樹脂預(yù)處理[18]首先使用無水乙醇攪拌浸泡離子交換樹脂4h；隨后用去離子水反復(fù)漂洗至無乙醇?xì)埩簦匀コ龢渲锏挠袡C溶劑和雜質(zhì)殘留；再用8 倍體積的1mol/L HCl 攪拌浸泡8h，用去離子水反復(fù)沖洗至中性；隨后再用1mol/L NaOH攪拌浸泡8h，用去離子水反復(fù)沖洗至中性；最后用8 倍體積的1mol/L HCl 攪拌浸泡8h，用去離子水洗至中性備用。經(jīng)過上述酸-堿-酸的浸泡方式處理后，陰離子交換樹脂轉(zhuǎn)型為氯型，陽離子交換樹脂處理成氫型。

（2）大孔吸附樹脂預(yù)處理[19]將新購的DM700型大孔樹脂用乙醇浸泡24h，使之充分膨脹，去除上面漂浮的碎片和雜物后濕法上柱，用乙醇沖洗至流出液與水混合不產(chǎn)生渾濁后，用2%的NaOH 溶液浸泡洗脫，用蒸餾水洗脫至中性，再用乙醇浸泡洗脫，最后用水沖洗至無醇味，備用。

1.2.3 脫色、脫鹽、脫蛋白處理

將經(jīng)過板框處理的發(fā)酵液依次通過陽離子交換樹脂、陰離子交換樹脂、吸附樹脂進行脫色、脫鹽、脫蛋白處理[20]。樹脂吸附流速為1～2BV/h。

1.2.4 超濾-納濾濃縮處理

在超濾處理過程中，首先考察0～30min內(nèi)超濾膜通量的變化情況。

將通過樹脂柱的發(fā)酵液先通過卷式超濾膜，進一步去除殘留在發(fā)酵液中的無機鹽、小分子以及殘留底物等，使得發(fā)酵液具有進行納濾濃縮的條件。超濾壓力為5MPa、超濾膜截流分子量為1萬～2萬、面積為2m2，超濾至發(fā)酵液全部通過。收集超濾之后的發(fā)酵液，納濾濃縮5～10倍[21-22]，對納濾處理后的發(fā)酵液進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)以去除納濾液中的部分水分，得到含水量較低的槐糖脂產(chǎn)品。

（1）通量（J）的測定[18]以0.1MPa 的壓力過膜超濾，預(yù)壓15min后，收集一定時間內(nèi)通過膜的溶劑體積。計算見式(1)。

（2）截留率（R）的測定[18]將經(jīng)過處理工藝的槐糖脂濾液，以0.1MPa 的壓力過膜超濾，被膜截留的溶質(zhì)占溶液中該溶質(zhì)總量的百分比即為截留率。計算見式(2)。

式中，C1為透過液的濃度；V1為透過液的體積；C0為物料的進料濃度；V0為物料的進料體積。

1.2.5 槐糖脂產(chǎn)量的測定[4]

DNS 法測定發(fā)酵液中的葡萄糖含量，蒽酮-硫酸法測定發(fā)酵液中槐糖脂的總含量。

1.2.6 槐糖脂的純度測定[23]

將上樣溶液用0.22μm 的微孔濾膜進行過濾，濾后使用HPLC 分析其主要組成和純度?；碧侵琀PLC 檢測條件：色譜柱為KromasiL C18分析柱（5μm×250nm×4.6mm，Agela Technologies Inc.）；流動相為乙腈-水；檢測波長為207nm；進樣體積為20μL；流速為1mL/min。梯度洗脫（體積分?jǐn)?shù)）：0～15min乙腈含量從40%升高至60%，15～30min乙腈含量從60%升高至70%，35～40 min 乙腈含量從70%升高至90%，40～55min乙腈含量維持90%。

2 結(jié)果與討論

槐糖脂發(fā)酵液的預(yù)處理與不同結(jié)構(gòu)槐糖脂的分離方法，包括以下步驟：①槐糖脂發(fā)酵液的預(yù)處理，包括高溫滅菌、自然冷卻、自然沉降等程序；②下層內(nèi)酯型槐糖脂的收集與處理；③上層發(fā)酵液中菌絲體的過濾去除；④除雜處理，包括樹脂吸附和超濾處理，用以除色素、除鹽、除蛋白等；⑤納濾濃縮至所設(shè)定的酸型槐糖脂濃度；⑥干燥，將步驟②和步驟⑤中所得不同結(jié)構(gòu)的槐糖脂產(chǎn)品烘干得到不同固體槐糖脂產(chǎn)品。

2.1 發(fā)酵液的預(yù)處理

由于菌體在厭氧條件下會分解產(chǎn)物，因此發(fā)酵結(jié)束后需對菌體進行滅活處理。菌體在高溫下無法生存，但溫度過高會造成升溫所帶來的能耗過大以及后續(xù)降溫時間的延長等問題，因此發(fā)酵結(jié)束后，將溫度升高到50℃進行滅菌處理40min[23]，然后自然降溫1.5h 使升溫帶來的熱量自然散失，自然降溫可以使溫度緩慢降低，在一定時間內(nèi)繼續(xù)滿足滅菌的需求，且無需產(chǎn)生額外的能源消耗和經(jīng)濟成本。同時關(guān)閉攪拌和降低空氣流量，發(fā)酵液中泡沫消去，內(nèi)酯型槐糖脂自然沉降，與菌體和剩余的菜籽油分離開來。由于密度不同，內(nèi)酯型槐糖脂沉淀在底部，菌體層在中間，部分與內(nèi)酯型槐糖脂混合，殘余的菜籽油在頂部，有些出現(xiàn)了乳化現(xiàn)象。將發(fā)酵液收集到細(xì)長形圓柱狀的容器中，下接高30cm、直徑2.5cm 的細(xì)長玻璃柱，細(xì)長玻璃柱底面積小且具有可視性，一方面便于內(nèi)酯型槐糖脂的富集，易于分離；另一方面可肉眼觀察到分離出內(nèi)酯型槐糖脂的界線，因此，使得后續(xù)的分離及收集更為方便。靜置20min后收集下層黏稠狀內(nèi)酯型槐糖脂。

2.2 菌絲體的過濾去除

2.2.1 助濾劑添加量的選擇

考察了助濾劑硅藻土的添加量對槐糖脂發(fā)酵液濁度、槐糖脂回收率及發(fā)酵液蛋白含量的影響，結(jié)果如圖1所示。

通過圖1可以發(fā)現(xiàn)，助濾劑硅藻土的添加量對濁度的影響較大。當(dāng)助濾劑硅藻土的添加量為0.5%時，與原發(fā)酵液相比，濁度降低了67.53%（為8.32NTU），但發(fā)酵液蛋白含量和槐糖脂含量并沒有明顯變化，因此可以認(rèn)為助濾劑的添加可以很大程度上將菌絲體濾除，但是對一些無機鹽，可溶性蛋白及其他物質(zhì)過濾效果較差。當(dāng)硅藻土的添加量達(dá)到1.0%時，硅藻土添加量的增大對濁度的降低影響有限，且會導(dǎo)致槐糖脂含量降低。因此，考慮到經(jīng)濟成本以及目標(biāo)物質(zhì)的獲得，本研究選擇1.0%的硅藻土添加量作為本實驗的最佳助濾劑添加量。

圖1 助濾劑添加量對過濾效果的影響

2.2.2 板框過濾濾布層數(shù)的選擇

確定硅藻土的添加量為1.0%后，考察了濾布的層數(shù)對槐糖脂回收率、菌體與菌液分離效果及發(fā)酵液蛋白含量的影響，結(jié)果如表1所示。

表1 濾布層數(shù)對過濾效果的影響

結(jié)果顯示：隨著濾布的增多，濁度逐漸下降，說明發(fā)酵液中的不溶性固體顆粒有所減少。但隨著更多濾布層數(shù)的增加，發(fā)現(xiàn)槐糖脂的含量也隨之降低，即槐糖脂回收率逐漸降低；且過濾速率也隨之降低，過濾時間延長，能耗增加。除此之外，發(fā)酵液中蛋白含量很低，板框過濾對其幾乎沒有影響。因此，考慮到經(jīng)濟成本以及槐糖脂回收率，本研究選擇4 層濾布作為本實驗的最佳濾布層數(shù)。

2.3 除雜處理

將濾后的發(fā)酵液進行脫色、脫鹽、脫蛋白處理[16]，考察了不同樹脂對槐糖脂發(fā)酵液的處理效果，結(jié)果如表2所示。

表2 樹脂對發(fā)酵液的除雜效果

將過濾之后的槐糖脂含量為64.73g/L的發(fā)酵液依次進樣到陽離子交換樹脂783、陰離子交換樹脂767 以及大孔吸附樹脂DM700 中，經(jīng)過樹脂處理后，發(fā)酵液的透光率達(dá)到87.41%。而在槐糖脂回收率方面，經(jīng)過陽離子交換樹脂的槐糖脂濃度為63.48g/L，流經(jīng)陰離子交換樹脂的槐糖脂濃度為62.02g/L，流經(jīng)大孔吸附樹脂的槐糖脂濃度為60.79g/L， 回 收 率 分 別 為98.07%、 97.70%、98.02%。濾后發(fā)酵液流經(jīng)整個除雜樹脂后，槐糖脂總回收率為93.91%，截留率為6.09%，工業(yè)上在可以接受的回收率范圍內(nèi)。

2.4 超濾-納濾濃縮工藝

預(yù)處理后的槐糖脂發(fā)酵液，經(jīng)過除雜樹脂后，仍然可能存在無機鹽、小分子物質(zhì)以及殘留底物等[18]。如果此時直接進行納濾濃縮，一方面會導(dǎo)致物質(zhì)的純度較低，另一方面會導(dǎo)致納濾堵塞，污染，設(shè)備損壞。因此本研究首先利用超濾系統(tǒng)對其進行進一步除雜，再利用納濾進行濃縮，以得到含量較高、雜質(zhì)較少的槐糖脂產(chǎn)品。此外，為了去除納濾液中的部分水分，得到含水量較低的產(chǎn)品，對納濾處理后的發(fā)酵液進行了旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)操作。

2.4.1 超濾膜通量隨著時間的變化

超濾處理工藝確定過程中，考察了隨著時間的延長，超濾膜通量的變化情況，結(jié)果如圖2所示。

圖2 超濾膜通量隨時間的變化情況

由圖2可以看出，隨著時間的延長，超濾膜通量隨之下降，但下降趨勢并不明顯，不影響超濾的正常進行。30L 槐糖脂含量為60.79g/L 的發(fā)酵液經(jīng)過超濾處理后，得到35L 槐糖脂含量為46.92g/L 的超濾液。槐糖脂回收率為90.05%。

2.4.2 納濾濃縮效果分析

將超濾液進行納濾濃縮，共獲得4L 濃度為346.8g/L 的槐糖脂納濾濃縮液，槐糖脂回收率為84.47%，濃縮效果優(yōu)良。根據(jù)需求，可將所得濃縮納濾液再經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除殘留水分，獲得深褐色黏稠狀槐糖脂產(chǎn)品。

2.5 純化后槐糖脂純度的比較測定

為了考察獲得的不同結(jié)構(gòu)的槐糖脂的純度，本研究將發(fā)酵得到的總槐糖脂、分離純化后得到的內(nèi)酯型槐糖脂、酸型槐糖脂及某市售槐糖脂產(chǎn)品進行了HPLC分析，結(jié)果如圖3所示。

從4種槐糖脂的高效液相圖譜可以看出，處理后槐糖脂樣品的雜質(zhì)峰較少，酸型槐糖脂在10min內(nèi)基本出峰完畢，圖譜中未出現(xiàn)內(nèi)酯型槐糖脂對應(yīng)的特征峰[圖3(a)]；內(nèi)酯型槐糖脂的組分多些，但主要組分的保留時間分別為27min 和32min，且其圖譜中酸型槐糖脂對應(yīng)的特征峰較少[圖3(b)]；這兩者均說明本文所述方法取得的分離純化效果較好?？偦碧侵腍PLC圖譜中，酸型槐糖脂和內(nèi)酯型槐糖脂的組分對應(yīng)的保留時間及峰形與前述兩種槐糖脂的HPLC圖譜一致，且兩種槐糖脂組分的特征峰能很好地分離[圖3(c)]。而目前市售槐糖脂產(chǎn)品主要為酸型槐糖脂和內(nèi)酯型槐糖脂的復(fù)雜混合物，組分較為復(fù)雜。HPLC 圖譜則顯示其含有大量的極性較強、結(jié)構(gòu)未知的雜質(zhì)峰[圖3(d)]。

表3 中比較了上述4 種樣品所含不同槐糖脂分子的峰面積的百分比。可以看出，在本研究處理工序條件下，所得內(nèi)酯型槐糖脂的純度為84.47%，酸型槐糖脂的純度為99.46%；總槐糖脂產(chǎn)品中內(nèi)酯型和酸型槐糖脂的含量分別為67.38%、32.62%；市售產(chǎn)品中內(nèi)酯型槐糖脂的含量為50.18%，酸型槐糖脂的含量為49.82%。上述數(shù)據(jù)顯示，利用本方法可以達(dá)到對槐糖脂發(fā)酵液進行分離純化，獲得不同槐糖脂產(chǎn)品的目的，且不同類型槐糖脂產(chǎn)品的純度優(yōu)于市售產(chǎn)品。

3 結(jié)論

本研究基于槐糖脂發(fā)酵液的理化指標(biāo)和特性，以工廠現(xiàn)有設(shè)備為基礎(chǔ)，分別利用自然沉降法和板框過濾-樹脂吸附-超濾納濾濃縮法成功獲得內(nèi)酯型槐糖脂和酸型槐糖脂產(chǎn)品。

圖3 酸型槐糖脂、內(nèi)酯型槐糖脂、總槐糖脂及某市售槐糖脂的HPLC圖譜分析比較

優(yōu)化確定板框過濾過程中的濾布層數(shù)以及助濾劑硅藻土的添加量后，本研究采用的超濾-納濾的濃縮方法可以進一步去除經(jīng)樹脂吸附處理后的發(fā)酵液中仍存在的一些不溶性物質(zhì)和減少發(fā)酵液的體積。

表3 不同槐糖脂產(chǎn)品的純度比較分析表

HPLC 圖譜表明，經(jīng)分離純化后，兩種槐糖脂的純度達(dá)到了很高的水平，說明本法可以對槐糖脂發(fā)酵液進行分離純化，獲得不同的槐糖脂產(chǎn)品，且獲得產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)均達(dá)到市售標(biāo)準(zhǔn)，質(zhì)量優(yōu)于市售產(chǎn)品。此分離方法豐富了槐糖脂類產(chǎn)品的品種，填補了市售產(chǎn)品均為內(nèi)酯型和酸型槐糖脂混合物的缺陷，使得不同類型的槐糖脂產(chǎn)品具有更具針對性、更為清晰和明確的應(yīng)用方向。另外，該分離純化工藝可以減少或去除有機試劑的使用，處理過程不涉及化學(xué)反應(yīng)，提高了槐糖脂生產(chǎn)的安全性與環(huán)保性。

本研究隨后的中試生產(chǎn)中，自然冷卻法被用于降低高溫滅菌后的發(fā)酵液的溫度，旋蒸法被用于脫去納濾濃縮后發(fā)酵液的殘余水分，但這兩種方法的冷卻效率和濃縮效率均較低，在槐糖脂的工業(yè)化生產(chǎn)中將采用冷卻塔冷卻和薄膜蒸發(fā)濃縮的方法替代上述兩種方法，以提高槐糖脂的生產(chǎn)效率。