海馬區(qū)微循環(huán)障礙在蛛網(wǎng)膜下腔出血后認(rèn)知障礙中的作用及其機(jī)制研究

周永志 張小兵 王建莉 俞學(xué)斌

動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血（subarachnoid hemorrhage，SAH）是由顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂引起的，約占自發(fā)性SAH的80%；經(jīng)過積極治療后，相當(dāng)比例的患者神經(jīng)功能完全康復(fù)，達(dá)到臨床上的所謂“治愈”，但近年來研究發(fā)現(xiàn)，半數(shù)以上的幸存者中存在不同程度及多個(gè)認(rèn)知領(lǐng)域的功能障礙[1-3]，嚴(yán)重影響其功能預(yù)后及生活質(zhì)量[4-5]。眾所周知，海馬組織在實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期記憶、概念形成、空間導(dǎo)航等多種認(rèn)知功能中起著至關(guān)重要的作用，海馬區(qū)損傷可導(dǎo)致明顯的認(rèn)知障礙[6-7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，SAH患者在發(fā)病早期即存在不同程度的海馬區(qū)微循環(huán)障礙，而海馬區(qū)持續(xù)微循環(huán)障礙可導(dǎo)致海馬神經(jīng)元凋亡壞死和海馬萎縮，進(jìn)而導(dǎo)致相應(yīng)的功能障礙[2]。但臨床上對(duì)患者發(fā)生動(dòng)脈瘤性SAH后海馬區(qū)早期微循環(huán)及局部神經(jīng)元損傷情況、認(rèn)知障礙發(fā)生情況知之甚少。本研究首先利用CT灌注成像（CT perfusion image，CTP）對(duì)動(dòng)脈瘤性SAH患者海馬區(qū)局部微循環(huán)狀況進(jìn)行了測(cè)定，比較有、無認(rèn)知障礙患者發(fā)病后10 d雙側(cè)海馬區(qū)微循環(huán)灌注參數(shù)；同時(shí)建立小鼠SAH模型，采用水迷宮法評(píng)估小鼠認(rèn)知障礙情況并分析其與神經(jīng)元凋亡的關(guān)系，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2017年1月至2019年1月紹興市人民醫(yī)院收治的138例動(dòng)脈瘤性SAH患者為研究對(duì)象，均經(jīng)CT或腰椎穿刺檢查證實(shí)存在自發(fā)性SAH，經(jīng)CT血管成像和（或）腦血管造影檢查確定為顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂；經(jīng)開顱動(dòng)脈瘤夾閉或介入栓塞治.療后預(yù)后良好，格拉斯哥結(jié)局評(píng)分4～5分。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）HUNT-HESS分級(jí)5級(jí)；（2）改良FISHER分級(jí)0級(jí)；（3）有神經(jīng)內(nèi)外科疾病史；（4）精神障礙或智力低下；（5）不能配合評(píng)估者。根據(jù)發(fā)病后6個(gè)月蒙特利爾認(rèn)知評(píng)估量表（MoCA）評(píng)分，存在認(rèn)知障礙（≤26分）63例，無認(rèn)知障礙（＞26分）75例；兩組患者在性別、年齡、受教育年限以及動(dòng)脈瘤大小、部位、治療方式等方面比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查通過，所有患者簽署知情同意書。

1.2 CTP檢查 患者發(fā)病后10 d，采用佳能320層螺旋CT掃描儀進(jìn)行常規(guī)橫斷面掃描，層厚和層間距均為2 mm；然后選取重點(diǎn)層面（經(jīng)基底核區(qū)域?yàn)榈讟?biāo)準(zhǔn)層面）進(jìn)行CTP掃描檢查。利用Perfusion CT隨機(jī)軟件對(duì)重組動(dòng)態(tài)圖像進(jìn)行后續(xù)處理，去除所有動(dòng)態(tài)圖像上的顱骨輪廓；用定義CT值的方法排除腦脊液的影響，并對(duì)圖像進(jìn)行平滑處理以減小噪聲，最后分析所有動(dòng)態(tài)圖像并得到一系列腦灌注參數(shù)圖，包括腦血流量（CBF）、腦血容量（CBV）、對(duì)比劑平均通過時(shí)間（MTT）和達(dá)峰時(shí)間（TTP）4種圖像。由2位經(jīng)驗(yàn)豐富的神經(jīng)影像學(xué)診斷醫(yī)生對(duì)這些圖像進(jìn)行分析，選擇雙側(cè)海馬區(qū)為感興趣區(qū)，取灌注圖像中標(biāo)準(zhǔn)層面圖或包含感興趣區(qū)最完整的層面進(jìn)行CBF、CBV、TTP、MTT等參數(shù)測(cè)量，見圖1（插頁）。感興趣區(qū)在2或3個(gè)層面都包含時(shí)，取其平均值，代表相應(yīng)區(qū)域的局部腦血流灌注狀況。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.3.1 動(dòng)物分組與處理 將30只小鼠（購自浙江大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為兩組：模型組20只，假手術(shù)組10只。（1）模型組采用線栓法血管內(nèi)穿刺建立SAH模型。小鼠腹腔注射戊巴比妥（40 mg/kg）麻醉后，暴露右側(cè)頸動(dòng)脈及其分支。將鈍化的4-0單絲尼龍縫合線推入頸外動(dòng)脈，然后通過頸內(nèi)動(dòng)脈，直到出現(xiàn)阻力?？p合線再插入約3 mm，在頸內(nèi)動(dòng)脈分叉處附近穿刺血管制作SAH模型。（2）假手術(shù)組在縫合線通過小鼠頸內(nèi)動(dòng)脈遇到阻力時(shí)，將其取出，其余步驟與模型組相同。

表1 有、無認(rèn)知障礙患者一般資料比較

1.3.2 認(rèn)知功能評(píng)估 采用水迷宮實(shí)驗(yàn)法。建模前4 d訓(xùn)練小鼠尋找水中平臺(tái)，小鼠尋到平臺(tái)后停留60 s強(qiáng)化記憶，建模前及建模成功后第10天利用自動(dòng)攝像系統(tǒng)記錄小鼠尋找到平臺(tái)的時(shí)間，即潛伏時(shí)間。根據(jù)平均潛伏時(shí)間評(píng)估小鼠認(rèn)知功能，＜120 s為無存在認(rèn)知障礙，≥120 s為認(rèn)知障礙。

1.3.3 海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況檢測(cè) 采用原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）法。建模后第10天評(píng)估認(rèn)知功能后，采用脊椎脫臼法處死小鼠，斷頭取腦，切取雙側(cè)海馬組織，4%多聚甲醛固定過夜，置于10%、20%和30%的蔗糖溶液進(jìn)行梯度脫水，制成5 μm厚的冠狀冰凍切片。參照試劑盒說明書（C1088，北京碧云天生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行TUNEL免疫熒光染色，在熒光顯微鏡下觀察；每張切片隨機(jī)抽取5個(gè)不同的視野，使用Image J圖像分析法測(cè)定每個(gè)視野的光密度值并取平均值，即凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)；兩組比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 有、無認(rèn)知障礙患者發(fā)病后10 d雙側(cè)海馬區(qū)微循環(huán)灌注參數(shù)比較 與無認(rèn)知障礙組比較，認(rèn)知障礙組患者雙側(cè)海馬區(qū)CBF下降，MTT、TTP均明顯延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；兩組患者雙側(cè)海馬區(qū)CBV比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表2。

2.2 小鼠認(rèn)知功能評(píng)估結(jié)果 經(jīng)水迷宮實(shí)驗(yàn)評(píng)估，模型組20只小鼠存在認(rèn)知障礙8只，無認(rèn)知障礙12只。認(rèn)知障礙組、無認(rèn)知障礙組、假手術(shù)組潛伏時(shí)間分別為（160.9±38.4）、（70.9±28.2）、（63.5±35.6）s，認(rèn)知障礙組較無認(rèn)知障礙組明顯延長(zhǎng)（P＜0.05），假手術(shù)組與無認(rèn)知障礙組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 小鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)比較 熒光顯微鏡下可見模型組小鼠海馬CA3區(qū)存在較多細(xì)胞凋亡，而假手術(shù)組僅見少量凋亡細(xì)胞，見圖2（插頁）。與無認(rèn)知障礙組相比，認(rèn)知障礙組小鼠凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表 3。

圖1 雙側(cè)海馬區(qū)CT灌注成像（CTP）圖像上腦血流量（CBF）、腦血容量（CBV）、對(duì)比劑平均通過時(shí)間（MTT）及達(dá)峰時(shí)間（TTP）參數(shù)測(cè)量

圖2 小鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡情況（a：假手術(shù)組；b：無認(rèn)知障礙組；c：認(rèn)知障礙組；免疫熒光染色，×400）

3 討論

有臨床研究表明，海馬體與記憶、空間導(dǎo)航及執(zhí)行力關(guān)系密切，海馬損傷可引起注意力缺陷，海馬區(qū)微循環(huán)障礙進(jìn)而導(dǎo)致的海馬萎縮被認(rèn)為是診斷阿爾茨海默病的可靠生物學(xué)標(biāo)志[3]。對(duì)于SAH，近年來臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)存在明顯血流灌注下降和局部腦微循環(huán)障礙[4]。Yamamoto等[5]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)異氟醚誘導(dǎo)的小鼠持續(xù)低血壓，可導(dǎo)致明顯認(rèn)知障礙，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)這些小鼠海馬區(qū)存在明顯的血流灌注降低和微循環(huán)障礙，同時(shí)免疫組化染色結(jié)果顯示海馬CA1區(qū)存在明顯的神經(jīng)元損傷，這表明海馬區(qū)低灌注和微循環(huán)障礙與認(rèn)知障礙存在明顯相關(guān)性。Takata等[6]建立小鼠模型探討SAH后長(zhǎng)期認(rèn)知障礙的發(fā)病機(jī)制，發(fā)現(xiàn)與假手術(shù)組相比，SAH組小鼠水迷宮逃逸潛伏時(shí)間、游泳距離均明顯增加，病理學(xué)切片檢查顯示SAH組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少，同時(shí)免疫組化染色結(jié)果也顯示海馬區(qū)存在明顯的微血管及神經(jīng)元DNA氧化損傷，碳-14放射自顯影技術(shù)檢查顯示海馬區(qū)腦動(dòng)脈直徑改變不明顯，但在出血早期（3～7 d）局部腦血流量明顯減少，即使14 d后局部微循環(huán)灌注仍不完全，這提示局部存在明顯的微循環(huán)障礙。以上研究結(jié)果均表明，海馬區(qū)持續(xù)微循環(huán)灌注不足以及由此導(dǎo)致的局部神經(jīng)元數(shù)量減少在SAH后長(zhǎng)期認(rèn)知障礙中起重要作用。

表2 有、無認(rèn)知障礙患者發(fā)病后10 d雙側(cè)海馬區(qū)微循環(huán)灌注參數(shù)比較

表3 3組小鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡數(shù)比較

CTP是一種新的血流動(dòng)力學(xué)評(píng)價(jià)技術(shù)，相關(guān)參數(shù)可以從不同角度來反映腦血流灌注情況，可以在患者出現(xiàn)臨床癥狀前就敏感地發(fā)現(xiàn)SAH導(dǎo)致的局部腦血流動(dòng)力學(xué)異常和微循環(huán)障礙[7]。SAH患者發(fā)病后腦血管痙攣及其引發(fā)的微循環(huán)障礙一般發(fā)生在出血后4～14 d，其中第8～10天為腦血管痙攣高峰期。因此，本研究評(píng)估了動(dòng)脈瘤性SAH患者發(fā)病后10 d的CTP灌注參數(shù)，結(jié)果顯示與無認(rèn)知障礙組相比，認(rèn)知障礙組患者海馬區(qū)多項(xiàng)灌注參數(shù)明顯改變，表現(xiàn)為CBF明顯減少，MTT和TTP明顯延長(zhǎng)，提示局部灌注明顯不足，存在明顯的微循環(huán)灌注障礙。結(jié)合發(fā)病后6個(gè)月MoCA量表評(píng)分進(jìn)一步分析，結(jié)果顯示灌注參數(shù)變化越明顯，越容易出現(xiàn)認(rèn)知障礙。由此推斷雙側(cè)海馬區(qū)微循環(huán)功能灌注障礙與動(dòng)脈瘤性SAH后認(rèn)知障礙存在明顯的相關(guān)性。

但是，目前關(guān)于海馬持續(xù)微循環(huán)障礙如何導(dǎo)致認(rèn)知障礙的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。Lee等[8]隨訪了動(dòng)脈瘤性SAH患者出血6個(gè)月后海馬區(qū)灰質(zhì)體積（MRI檢查），結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未破裂組相比，動(dòng)脈瘤性SAH患者海馬區(qū)灰質(zhì)體積明顯減少，且海馬容量減少與預(yù)后評(píng)分下降有關(guān)，提示動(dòng)脈瘤性SAH可導(dǎo)致遠(yuǎn)期海馬體積減少，但海馬體積減少的機(jī)制并不明確。Luo等[9]研究發(fā)現(xiàn)，缺牙可導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)空間認(rèn)知障礙；進(jìn)一步探究發(fā)病機(jī)制發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)小鼠雙側(cè)海馬區(qū)CBF降低，海馬組織中Bax/Bcl-2、Caspase-3 mRNA表達(dá)升高，CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量減少。Bax、Bcl-2是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，Caspase-3是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡的主要效應(yīng)因子。該研究還認(rèn)為牙齒脫落引起小鼠空間認(rèn)知障礙的潛在機(jī)制與海馬CBF降低引起的局部持續(xù)微循環(huán)障礙進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增加有關(guān)。本研究建立了小鼠SAH模型，并采用水迷宮法評(píng)價(jià)其認(rèn)知功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組與無認(rèn)知障礙組潛伏時(shí)間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而認(rèn)知障礙組較無認(rèn)知障礙組潛伏時(shí)間明顯延長(zhǎng)；同時(shí)TUNEL染色結(jié)果顯示認(rèn)知障礙組小鼠雙側(cè)海馬區(qū)細(xì)胞凋亡增多，提示認(rèn)知障礙與海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡增加具有明顯的相關(guān)性。

結(jié)合臨床研究發(fā)現(xiàn)的有認(rèn)知障礙的SAH患者雙側(cè)海馬區(qū)存在明顯微循環(huán)障礙，以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的有認(rèn)知障礙的小鼠海馬區(qū)細(xì)胞凋亡增多的結(jié)果，筆者推斷海馬區(qū)持續(xù)微循環(huán)障礙導(dǎo)致的局部神經(jīng)元凋亡增加在SAH后認(rèn)知障礙發(fā)病機(jī)制中起重要作用，理由如下：（1）海馬是對(duì)缺血最敏感的腦區(qū)之一，海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量減少和萎縮與記憶力下降有關(guān)，是阿爾茨海默病最具特征性的神經(jīng)病理學(xué)損傷區(qū)域。（2）對(duì)于SAH后認(rèn)知障礙，近年來臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)存在血流灌注下降，低灌注是所有腦缺血病因的最后通路，當(dāng)CBF低于正常水平的30%時(shí)，神經(jīng)元電活動(dòng)停止，在細(xì)胞器水平，線粒體氧化磷酸化停止，從而進(jìn)一步引起缺血、缺氧級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)，而持續(xù)灌注不足可導(dǎo)致缺血敏感區(qū)神經(jīng)元不可逆死亡，以后即使恢復(fù)血流，細(xì)胞也無法復(fù)活[10]。本研究發(fā)現(xiàn)有認(rèn)知障礙的動(dòng)脈瘤性SAH患者雙側(cè)海馬區(qū)CBF下降和MTT延長(zhǎng)尤其明顯，因此認(rèn)為雙側(cè)海馬區(qū)CBF和MTT的持續(xù)異常改變預(yù)示著該區(qū)域存在著持續(xù)微循環(huán)障礙，由此引起神經(jīng)元凋亡增加和功能障礙最終導(dǎo)致了認(rèn)知障礙的發(fā)生。