番茄Pti6基因遺傳轉(zhuǎn)化與分析

張 政, 王瑩瑩, 馮國(guó)棟, 王瑞鵬, 徐煥煥, 牛向麗

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

番茄是廣泛種植的果蔬類重要經(jīng)濟(jì)作物,同時(shí)也是研究果實(shí)發(fā)育、植物病害的模式植物[1-2]。為保障其產(chǎn)量、品質(zhì),需要防治病害的發(fā)生。因此,對(duì)抗病番茄品種的培育及其抗性機(jī)理的探討成為一個(gè)重要的研究?jī)?nèi)容。

植物在與病原微生物的攻防協(xié)同進(jìn)化中形成了復(fù)雜的防御機(jī)制,包括對(duì)病原微生物的感知、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗病基因表達(dá),最終激活抗病相關(guān)酶,合成防衛(wèi)次生代謝物[3-5]。如過(guò)氧化氫酶(Catalase,CAT)、過(guò)氧化物酶(Peroxidase,POD)和苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonialyase,PAL)等,在植物受到病原菌侵襲時(shí)表達(dá)量升高、活性增強(qiáng),參與活性氧清除和酚類等抗病代謝物質(zhì)的合成,以增強(qiáng)植物對(duì)病害的防御能力[6]。

番茄Pto基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是抵御丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)的重要抗性蛋白。它通過(guò)與效應(yīng)蛋白Avrpto/AvrptoB結(jié)合感知病原菌,啟動(dòng)防御途徑,但對(duì)其抗病分子途徑尚未完全闡明[7-8]。Pti6是可以與Pto互作的蛋白之一,編碼轉(zhuǎn)錄因子，被認(rèn)為是Pto介導(dǎo)抗病途徑的下游基因[9]。本研究通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)方法進(jìn)行番茄遺傳轉(zhuǎn)化,以獲得Pti6過(guò)量表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株,可以對(duì)其功能進(jìn)行分析。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 番茄材料

野生番茄(Solanumlycopersicumcv. AC+)來(lái)自美國(guó)康奈爾大學(xué)植物研究所。

1.1.2 質(zhì)粒和試劑

植物表達(dá)載體pBI121、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株EHA105由本實(shí)驗(yàn)室保存;高保真DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶購(gòu)于TaKaRa公司;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒、植物基因組提取試劑盒、RNA提取反轉(zhuǎn)錄試劑盒以及定量PCR試劑盒購(gòu)于TransGen公司;植物組織培養(yǎng)試劑購(gòu)于Sigma公司;其余試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純;引物合成和測(cè)序由生工生物工程有限公司完成。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 農(nóng)桿菌介導(dǎo)番茄遺傳轉(zhuǎn)化

選取野生型番茄AC+種子,75%乙醇浸泡1 min后以無(wú)菌水清洗,再以15%次氯酸鈉溶液處理15 min,滅菌水反復(fù)清洗。將表面滅菌的種子轉(zhuǎn)移至無(wú)菌濾紙上,待水分吸干后,均勻放于1/2MS培養(yǎng)基,28 ℃,暗培養(yǎng)。約3 d種子露白后,將其移至光照條件下生長(zhǎng)。培養(yǎng)約7 d后,在超凈工作臺(tái)中將無(wú)菌番茄幼苗葉子和莖剪下,將葉片以鑷子戳孔和莖段分別放置于預(yù)培養(yǎng)基MS(20 g/L 蔗糖,1 g/L 6-芐氨基腺嘌呤,1 g/L 吲哚乙酸)誘導(dǎo)愈傷組織形成。

將轉(zhuǎn)入Pti6過(guò)表達(dá)載體pBI121-Pti6的農(nóng)桿菌在帶有利福平(Rifampicin,Rif),10 mg/mL和卡拉霉素(Kalamycin,Kana),50 mg/mL的LB培養(yǎng)板上劃線,28 ℃培養(yǎng)2 d。挑取單克隆于帶有Rif和Kana的LB液體培養(yǎng)基,28 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。然后將菌液進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí),5 000 r/min離心5 min,棄上清。將菌體在滅菌誘導(dǎo)液(pH=5.6、0.5 mol/L磷酸緩沖液,1 g/L NaCl,0.15 g/L KCl,0.15 g/L CaCl2·2H2O,2.5×10-3mg/L FeSO4,0.03 g/L MgSO4·7H2O,200 g/L 葡萄糖,0.5 mol/L 2-嗎啉乙磺酸,0.2 mol/L 乙酰丁香酮)中重懸,侵染植物莖、葉愈傷組織15 min。以滅菌濾紙吸干多余菌液,將侵染的葉片和莖段置于共培養(yǎng)基MS(20 g/L 蔗糖,1 g/L 激動(dòng)素,1 g/L 2, 4-二氯苯氧乙酸,0.2 mol/L乙酰丁香酮),25 ℃光照培養(yǎng)2 d。依次用不同質(zhì)量濃度的卡那霉素(60、65、70 μg/mL)培養(yǎng)基進(jìn)行梯度篩選培養(yǎng)各約25 d。待愈傷組織分化后將形成的番茄小苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基MS(20 g/L蔗糖,0.1 g/L羧芐青霉素,50 mg/mL 卡那霉素,1 g/L吲哚乙酸),根系發(fā)育完全后移栽入營(yíng)養(yǎng)土中,在溫室里生長(zhǎng)。

1.2.2 Pti6過(guò)表達(dá)番茄植株鑒定

通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化將Pti6基因、篩選標(biāo)記基因NPTⅡ(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶Ⅱ)共同轉(zhuǎn)入植物基因組中。以篩選標(biāo)記基因設(shè)計(jì)引物NPTⅡF/R見(jiàn)表1所列,野生型番茄基因組DNA為負(fù)對(duì)照、pBI121質(zhì)粒為陽(yáng)性對(duì)照,進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction, PCR)擴(kuò)增,以初步鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。

進(jìn)一步設(shè)計(jì)real-time定量PCR[10-11]引物RTPTI6F和RTPTI6R,見(jiàn)表1所列,以UB13作為內(nèi)參基因,分別提取野生型、Pti6過(guò)表達(dá)陽(yáng)性植株的葉片RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA作為模板,進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增,檢測(cè)Pti6基因的表達(dá)水平。

表1 本研究所用引物序列

1.2.3 Pti6過(guò)表達(dá)對(duì)CAT、POD的影響

以液氮將番茄外果皮研磨成粉末,取0.2 g于1.5 mL EP管中,加入1 mL冰上預(yù)冷的PBS溶液(0.1 mol/L KH2PO4,0.1 mol/L Na2HPO4,pH 值7.0),充分混勻,低溫(4 ℃)10 000g離心10 min,上清即為粗酶液,進(jìn)行以下測(cè)定。

(1) CAT量的測(cè)定[12]。吸取30 μL粗酶液,加入240 μL 0.05 mol/L PBS緩沖液,混勻后置于酶標(biāo)板中。迅速加入30 μL 0.1 mol/L 過(guò)氧化氫溶液,震蕩5 s后立即測(cè)定240 nm吸光度,每隔30 s再測(cè)量1次OD240,連續(xù)測(cè)量10次。每g番茄中CAT物質(zhì)的量的計(jì)算公式為:

其中,ΔA240/t為吸光值的變化斜率,ΔA240為變化值;Vt為提取酶液體積;Vs為反應(yīng)體系中提取液體積;FW為番茄樣品質(zhì)量。

(2) POD量的測(cè)定[13]。吸取60 μL粗酶液,加入210 μL 0.3%愈創(chuàng)木酚,30 ℃孵育10 min。加入0.1 mol/L過(guò)氧化氫溶液,震蕩5 s后立即測(cè)定470 nm吸光度。每隔30 s再測(cè)量1次OD470,連續(xù)測(cè)量10次。每g番茄中POD物質(zhì)的量的計(jì)算公式為:

其中,ΔA470/t為吸光值的變化斜率,A470為變化值;Vt為提取酶液體積;Vs為反應(yīng)體系中提取液體積;FW為番茄樣品質(zhì)量。

(3) MDA量的測(cè)定[14]。吸取300 μL粗酶液,加入0.5 mL的0.5% TBA溶液(0.5%硫代巴比妥酸,10%三氯乙酸),95 ℃加熱20 min后迅速冰浴5 min,然后4 ℃,1 000g離心10 min。取300 μL上清液于酶標(biāo)板中,檢測(cè)450、532 、600 nm吸光度。每g番茄中MDA物質(zhì)的量的計(jì)算公式為:

n(MDA)=

其中,Vt為提取酶液體積;Vs為反應(yīng)體系中提取液體積;FW為番茄樣品質(zhì)量。

各實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。測(cè)定數(shù)據(jù)利用SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 Pti6基因過(guò)表達(dá)植株的獲得

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)Pti6基因進(jìn)行番茄遺傳轉(zhuǎn)化。Pti6基因番茄遺傳轉(zhuǎn)化如圖1所示,經(jīng)過(guò)愈傷組織誘導(dǎo)、農(nóng)桿菌侵染、篩選培養(yǎng)、組織分化和再生,最終獲得11株獨(dú)立的Pti6過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。

圖1 Pti6基因番茄遺傳轉(zhuǎn)化

2.2 Pti6過(guò)表達(dá)番茄植株鑒定

分別提取野生型AC+和Pti6轉(zhuǎn)基因植株的基因組DNA,以篩選標(biāo)記基因NPTⅡ特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)入基因的番茄植株擴(kuò)增得到與正對(duì)照相同的約750 bp的預(yù)期條帶,而野生型未有擴(kuò)增條帶如圖2a所示,表明已獲得轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性番茄植株。進(jìn)一步提取野生型、陽(yáng)性植株RNA,反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行定量PCR。Pti6表達(dá)水平如圖2b所示。

圖2 Pti6過(guò)表達(dá)植株鑒定

圖2中,M表示DNA Marker;P表示pBI121質(zhì)粒,陽(yáng)性對(duì)照;1～11分別表示Pti6轉(zhuǎn)基因番茄植株;N表示野生型番茄,陰性對(duì)照;*表示與野生型相比有顯著性差異(P<0.05)。

圖2結(jié)果表明,已獲得了Pti6表達(dá)水平高于野生型的3個(gè)獨(dú)立的過(guò)表達(dá)植株(分別命名為OE-1、OE-2和OE-3)。鑒定結(jié)果表明,植物表達(dá)載體插入片段已在番茄基因組中整合,并表達(dá)了過(guò)量的Pti6基因。

2.3 CAT、POD及MDA量的測(cè)定

本文對(duì)野生型、過(guò)表達(dá)植株(OE-1、OE-2、OE-3)果實(shí)中過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)及丙二醛(MDA)的量分別進(jìn)行測(cè)定。Pti6過(guò)表達(dá)番茄果實(shí)中CAT、POD及MDA的量如圖3所示。

圖3 Pti6過(guò)表達(dá)番茄果實(shí)中CAT、POD及MDA的量

結(jié)果表明與野生型相比,Pti6過(guò)表達(dá)番茄果實(shí)中CAT、POD的量顯著提高,而MDA的量有所降低,說(shuō)明Pti6基因表達(dá)水平的提高可以增強(qiáng)防御酶CAT、POD的活性,降低膜系統(tǒng)的損傷。圖3中相同字母表示無(wú)顯著差異,不同字母表示有顯著差異(P<0.05)。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)中利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)進(jìn)行Pti6基因遺傳轉(zhuǎn)化,經(jīng)基因組DNA、RNA水平的鑒定,獲得Pti6基因過(guò)表達(dá)番茄植株,并進(jìn)一步對(duì)Pti6過(guò)表達(dá)植株果實(shí)表型進(jìn)行了初步分析。

過(guò)氧化氫酶(CAT)可以將過(guò)氧化氫分解為水和氧氣,使植物體免受H2O2的傷害[15-17]。過(guò)氧化物酶(POD)作為植物體內(nèi)重要的呼吸酶類,它的活性高低直接影響了酚類物質(zhì)的代謝,并且與病原微生物的抗性密切相關(guān),是反映植物抗性的一個(gè)重要指標(biāo)[18]。它們均對(duì)植物起著重要的逆境保護(hù)作用。在Pti6過(guò)表達(dá)番茄果實(shí)中CAT、POD活性顯著提高。相應(yīng)地,作為植物體內(nèi)膜脂過(guò)氧化物重要產(chǎn)物之一,同時(shí)也是膜系統(tǒng)損傷程度、植物抗逆性重要反映指標(biāo)的丙二醛(MDA)[19-20],在Pti6過(guò)表達(dá)番茄中有所降低。表明Pti6可能通過(guò)促進(jìn)抗病相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá),最終使防御酶活性增強(qiáng),在宿主保護(hù)、抑制病原微生物生長(zhǎng)中發(fā)揮作用。

通過(guò)后續(xù)對(duì)本工作中所獲得Pti6過(guò)表達(dá)番茄株系的進(jìn)一步擴(kuò)繁,進(jìn)行較大規(guī)模植物葉片、果實(shí)病原菌接種實(shí)驗(yàn),并對(duì)Pti6過(guò)表達(dá)植株中激活的下游基因進(jìn)行分析,將有助于對(duì)Pti6功能以及Pto介導(dǎo)的抗病分子途徑的深入了解。