硫氧還蛋白相互作用蛋白在結(jié)腸癌中表達的變化及其調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細胞增殖機制研究

席連峰

（河南省滑縣中心醫(yī)院普外科 滑縣456400）

結(jié)腸癌是我國發(fā)病率較高的消化道惡性腫瘤之一，且近年來發(fā)病率呈逐步升高趨勢[1]。其發(fā)生與環(huán)境、飲食、遺傳因素及多種基因表達異常有關(guān)，但具體發(fā)病機制仍未完全闡明。硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）是一類氧化還原調(diào)節(jié)蛋白，與硫氧還蛋白結(jié)合后能夠使硫氧還蛋白清除自由基的抗氧化作用減弱，進而使細胞內(nèi)自由基增多并影響細胞增殖活力。已有研究報道，TXNIP在食管癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中均呈顯著的低表達趨勢，提示TXNIP可能具有抗腫瘤作用[2～3]。為了明確TXNIP在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的生物學作用，本研究首先通過臨床樣本分析了TXNIP在結(jié)腸癌中表達變化，而后通過離體培養(yǎng)結(jié)腸癌SW480細胞分析了TXNIP調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細胞增殖的機制?，F(xiàn)報道如下：

1 資料與方法

1.1 臨床樣本信息 選取2018年3月～2019年12月在我院接受根治性手術(shù)治療的結(jié)腸癌患者的結(jié)腸癌組織和癌旁組織，共54例。所有患者均經(jīng)術(shù)后病理證實為結(jié)腸癌，術(shù)前未接受過放化療或其他抗腫瘤治療，臨床病理資料完整。獲得結(jié)腸癌組織和癌旁組織后，在液氮內(nèi)冷凍30 min后取出，放入超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 實驗材料SW480細胞株購自中科院上海細胞資源中心，TXNIP慢病毒購自上海吉瑪公司，p38 MAPK抑制劑SB203580購自Sigma公司，RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司，MTS細胞增殖活力檢測試劑盒購自Promega公司，TXNIP、CyclinD1、Bcl-2、p53的單克隆抗體購自Abcam公司。多功能酶標儀及化學顯影儀均購自Bio-rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及分組SW480細胞用含有10%胎牛血清（FBS）的DMEM進行貼壁培養(yǎng)，貼壁細胞鋪滿90%后用胰蛋白酶進行消化并按1:3比例傳代；傳代得到足夠數(shù)量的SW480細胞后進行分組，對照組用不含藥物的DMEM處理，TXNIP組用TXNIP慢病毒感染，TXNIP+SB組用TXNIP慢病毒感染并用含20μmol/L的SB203580 DMEM處理。

1.3.2 細胞增殖活力檢測SW480細胞接種在96孔培養(yǎng)板內(nèi)，不同條件處理24 h后向培養(yǎng)孔內(nèi)加入MTS試劑盒的檢測液、20μl/孔，在培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后取出，充分震蕩培養(yǎng)板并在酶標儀上檢測波長490 nm處的吸光值、記錄為OD值。

1.3.3 Western blot檢測 結(jié)腸癌組織和癌旁組織，用RIPA蛋白裂解液對組織進行裂解并提取蛋白；SW480細胞接種在6孔培養(yǎng)板內(nèi)，不同條件處理24 h后用RIPA蛋白裂解液對細胞組織進行裂解并提取蛋白。得到蛋白后，用BCA試劑盒測定總蛋白含量并取30μg進行Western blot檢測，將蛋白樣本加入聚丙烯酰胺凝膠中并進行電泳、電轉(zhuǎn)膜、5%脫脂牛奶封閉及TXNIP、CyclinD1、Bcl-2、p53第一抗體孵育過夜。第2天，孵育第二抗體后在化學顯影儀中曝光得到蛋白條帶，根據(jù)條帶的灰度值計算蛋白表達量。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料的兩組間比較采用t檢驗、三組間比較采用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)腸癌中TXNIP表達的變化 結(jié)腸癌組織和癌旁組織中TXNIP的表達量分別為（0.36±0.07）和（0.91±0.16）。結(jié)腸癌組織中TXNIP的表達量明顯低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學意義（t=23.142，P=0.000）。見圖1。

圖1 結(jié)腸癌組織和癌旁組織中TXNIP的蛋白條帶

2.2 不同病理特征結(jié)腸癌中TXNIP表達的比較不同直徑結(jié)腸癌中TXNIP的表達量比較無顯著性差異（P＞0.05）；TNMⅢ期結(jié)腸癌中TXNIP的表達量明顯低于TNMⅠ～Ⅱ期結(jié)腸癌（P＜0.05）；低/未分化結(jié)腸癌中TXNIP的表達量明顯低于中/高分化結(jié)腸癌（P＜0.05）；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌中TXNIP的表達量明顯低于不合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌（P＜0.05）。見表1。

表1 不同病理特征結(jié)腸癌中TXNIP表達比較（±s）

表1 不同病理特征結(jié)腸癌中TXNIP表達比較（±s）

?

2.3 TXNIP慢病毒對SW480細胞增殖活力的影響TXNIP組SW480細胞的OD值明顯低于對照組（P＜0.05）；TXNIP+SB組SW480細胞的OD值明顯高于TXNIP組（P＜0.05）。見圖2。

圖2 三組SW480細胞增殖活力的比較

2.4 TXNIP慢病毒對SW480細胞中增殖基因表達的影響TXNIP組SW480細胞中CyclinD1、Bcl-2表達量明顯低于對照組，p53表達量明顯高于對照組（P＜0.05），TXNIP+SB組SW480細胞中CyclinD1、Bcl-2的表達量明顯高于TXNIP組，p53的表達量明顯低于TXNIP組（P＜0.05）。見圖3，表2。

圖3 三組SW480細胞中CyclinD1、Bcl-2、p53的蛋白條帶

表2 三組SW480細胞中CyclinD1、Bcl-2、p53表達量比較（±s）

表2 三組SW480細胞中CyclinD1、Bcl-2、p53表達量比較（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與TXNIP組比較，#P＜0.05。

?

3 討論

TXNIP是一類氧化還原調(diào)節(jié)蛋白，既拮抗硫氧還蛋白的抗氧化功能，也能調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的線粒體功能，最終實現(xiàn)對細胞增殖的抑制作用及對細胞凋亡的促進作用。已有多項離體細胞實驗證實，過表達TXNIP能夠使肝癌、前列腺癌、肺癌等多種惡性腫瘤細胞的凋亡被增強、增殖受抑制[4～5]。提示TXNIP能夠在離體惡性腫瘤細胞中發(fā)揮抗腫瘤作用。本研究在此基礎上具體分析了TXNIP在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中是否發(fā)揮抗腫瘤作用，通過分析結(jié)腸癌中TXNIP表達的變化可知：結(jié)腸癌組織中TXNIP的表達明顯減少且TNMⅢ期、低/未分化、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌中TXNIP表達減少的趨勢較TNMⅠ～Ⅱ期、中/高分化、不合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織更為明顯。說明TXNIP的低表達不僅參與了結(jié)腸癌的發(fā)生，還在結(jié)腸癌的病理進程中起到調(diào)控作用。結(jié)合TXNIP在離體細胞中抑制增殖、促進凋亡的作用推測，低表達的TXNIP能夠使其增殖抑制作用減弱，進而促進了結(jié)腸癌的發(fā)生與發(fā)展。

本研究為了驗證關(guān)于TXNIP調(diào)控結(jié)腸癌細胞增殖的推測，進一步以SW480結(jié)腸癌細胞株作為實驗對象，通過感染TXNIP慢病毒的方式使細胞中TXNIP發(fā)生過表達，在過表達TXNIP后對細胞增殖進行檢測。結(jié)果顯示，TXNIP組細胞的增殖活力明顯低于對照組，說明過表達TXNIP能夠降低SW480細胞的增殖活力、TXNIP具有抑制結(jié)腸癌細胞增殖的作用。CyclinD1、Bcl-2、p53是已知與結(jié)腸癌增殖和凋亡調(diào)控密切相關(guān)的基因，CyclinD1能夠在細胞周期中起到正向調(diào)控作用，加速細胞周期并使大量細胞進入有絲分裂階段、進而促進細胞增殖[6]。Bcl-2能夠在細胞凋亡中起到抑制作用，通過減少線粒體中細胞色素C的釋放來抑制線粒體途徑凋亡的發(fā)生，進而有利于細胞增殖[7]。p53能夠在細胞凋亡中起到正向調(diào)控作用，一方面通過增強caspase的活性來促進細胞凋亡，另一方面通過誘導細胞周期停滯來抑制細胞增殖[8]。本研究對上述增殖基因分析顯示，TXNIP組細胞中CyclinD1、Bcl-2的表達明顯減少，p53表達明顯增多，這一結(jié)果與細胞增殖活力的變化相吻合，說明TXNIP能夠使結(jié)腸癌細胞的增殖受到抑制。

在明確TXNIP參與結(jié)腸癌細胞增殖的調(diào)控后，本研究進一步深入探究了介導該調(diào)控作用的分子機制。糖尿病相關(guān)細胞實驗證實TXNIP能夠通過激活p38 MAPK通路來促進胰島MIN6細胞發(fā)生凋亡[9]；肝臟相關(guān)的動物實驗證實敲除TXNIP后能夠通過抑制p38 MAPK的激活來減輕肝細胞的缺血再灌注損傷。p38 MAPK屬于MAPK家族，發(fā)生活化后對細胞凋亡、細胞增殖、細胞周期等環(huán)節(jié)均具有調(diào)控作用[10]。SB203580是p38 MAPK激活的抑制劑，本實驗在過表達TXNIP的同時聯(lián)合使用SB203580，當p38 MAPK的激活被SB203580抑制后，TXNIP抑制SW480細胞增殖、調(diào)節(jié)SW480細胞中增殖基因表達的作用均明顯減弱，說明TXNIP抑制結(jié)腸癌細胞增殖的作用與p38 MAPK的激活有關(guān)。p38 MAPK通路的激活部分介導了TXNIP對結(jié)腸癌細胞增殖及相關(guān)基因表達的調(diào)控效應。

綜上所述，結(jié)腸癌中TXNIP的表達明顯減少且TXNIP能夠通過激活p38 MAPK通路來抑制結(jié)腸癌細胞增殖，今后可進一步設計動物實驗來驗證TXNIP對結(jié)腸癌移植瘤生長的調(diào)控作用。