利用AuNCs@GSH-CAP體系熒光增強(qiáng)檢測BSA的研究

程凱旋，尹建行，徐 娜*

(1.吉林化工學(xué)院 材料科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 吉林 132022；2.吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

蛋白質(zhì)是生命活動(dòng)的基礎(chǔ),許多重要的生命現(xiàn)象和生理活動(dòng)都是通過蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn).蛋白質(zhì)含量的變化與疾病息息相關(guān),因此許多疾病相關(guān)蛋白的檢測在病理學(xué)、基因組學(xué)等方面有重要的參考價(jià)值[1].

金納米簇(AuNCs)是一種新型的熒光納米材料，其由幾個(gè)乃至上百個(gè)的金原子組成，尺寸都是在納米級(jí)別，因此它的相關(guān)性質(zhì)也是介于金原子和金的大納米粒子之間的.因?yàn)榻鸺{米粒子具有獨(dú)特的尺寸效應(yīng)和良好的生物相容性，以及易于制備和生物功能化修飾，且具有發(fā)光性能好持續(xù)時(shí)間長、低毒性、反應(yīng)靈敏等特點(diǎn)，成為一種很有發(fā)展?jié)摿Φ男滦蜔晒馓结榌2-3].

本文首先利用谷胱甘肽(GSH)為保護(hù)劑、三水合四氯金酸氫(HAuCL4·3H2O)為還原劑，合成出金納米簇(AuNCs@GSH)，再加入CAP使金納米簇發(fā)生熒光猝滅得到(AuNCs@GSH-CAP)體系作為熒光探針，用于檢測BSA.通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)生熒光猝滅的金納米簇遇到BSA后，體系熒光強(qiáng)度有明顯的增強(qiáng)，并使用該方法對BSA的檢測限、線性范圍和選擇性等進(jìn)行初步的討論[4-7].

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

三水合四氯金酸氫(HAuCL4·3H2O)、谷胱甘肽(GSH)和氯霉素(CAP)購買于阿拉丁試劑有限公司(中國上海)，牛血清白蛋白(BSA)，其余實(shí)驗(yàn)試劑：氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、硝酸鉀(KNO3)、碳酸鈉(NaCO3)均購于天津市永大化學(xué)試劑有限公司，氨基酸(Met、Pro、Gly、Thr)均取自北京鼎國長勝生物科技有限公司(中國北京)，所有試劑均為分析純.超純水用于整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程.

觀察熒光效果用ZF-20D暗箱三用紫外分析儀，紫外波長254、365、254、365 nm，儀器功率40W(上海驥輝科學(xué)分析儀器有限公司)，熒光光譜采用F97XP熒光分光光度計(jì)測定，波長范圍：200～900 nm，波長精準(zhǔn)度：±0.4 nm(上海棱光).紫外可見光譜用UV-2200雙單色器雙光束紫外可見分光光度計(jì)測定，波長范圍：190～1 100 nm，波長精準(zhǔn)度：±0.25 nm(北京瑞利儀器).

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

1.2.1 AuNCs@GSH的制備

HAuCL4溶液(25 mol/L，0.4 mL)與GSH溶液(25 mol/L，0.6 mL)和4 mL超純水，在室溫下劇烈攪拌至混合物變?yōu)闊o色，然后在70 ℃水浴加熱條件下，繼續(xù)溫和攪拌24 h，得到金納米簇，最后將所得溶液在4 ℃條件下冷藏保存[8].

1.2.2 AuNCs@GSH-CAP體系對不同濃度的BSA的檢測

在完全相同的AuNCs@GSH溶液(2 mL)中加入相同濃度的CAP(400 μL)，混合均勻發(fā)生熒光猝滅后，分別加入不同濃度的BSA(0、1、5、10、20、40、60、80、100、120 μmol/L)孵育1 min之后，固定激發(fā)波長360nm處測試其熒光光譜.

1.2.3 AuNCs@GSH-CAP體系對BSA的選擇性檢測

2 結(jié)果與討論

2.1 AuNCs@GSH的表征

圖1是金納米簇的熒光發(fā)射譜和紫外譜圖，在紫外線波長為225～250 nm之間出現(xiàn)一個(gè)最大吸收波長243 nm，而在250～500 nm時(shí)沒有出現(xiàn)新的吸收峰，因此可推斷該熒光探針中沒有形成大粒徑的金顆粒.在波長為575～625 nm之間AuNCs@GSH的熒光強(qiáng)度出現(xiàn)峰值.

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2.2 AuNCs@GSH-CAP體系對BSA的檢測性能分析

由圖2(a)可以看出，AuNCs@GSH自身熒光強(qiáng)度較高，只加入CAP后熒光強(qiáng)度下降，這說明CAP使金納米簇發(fā)生熒光猝滅；在加入BSA后，熒光強(qiáng)度相較于只加入CAP明顯提高，這說明BSA能夠增強(qiáng)加入CAP后的金納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度.

如圖2(b)是AuNCs@GSH-CAP體系加入相同量的BSA后，隨著時(shí)間增加，0～10 min內(nèi)其熒光強(qiáng)度的圖，在整個(gè)孵育過程中，每隔1 min取一個(gè)樣進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)0 min時(shí)熒光強(qiáng)度最弱，孵育1 min后熒光強(qiáng)度基本達(dá)到峰值，之后的時(shí)間里熒光強(qiáng)度趨于穩(wěn)定的，這說明體系響應(yīng)時(shí)間較短，由此可以確定整個(gè)孵育時(shí)間為1 min，因此確定AuNCs@GSH-CAP體系可以對BSA進(jìn)行檢測.

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在完全相同的AuNCs@GSH溶液中加入相同濃度的CAP，混合均勻發(fā)生熒光猝滅后，分別加入不同濃度的BSA(0、1、5、10、20、40、60、80、100、120 μmol/L)孵育1 min之后，放入熒光光度計(jì)進(jìn)行分析，如圖3(a)所示，在613 nm為波長的熒光光譜中，在未加入BSA時(shí)，AuNCs@GSH因?yàn)镃AP發(fā)生熒光猝滅反應(yīng)，使其熒光強(qiáng)度較弱，隨著BSA的加入和濃度的增加，熒光強(qiáng)度隨之增加，由此可以得出BSA有著使AuNCs@GSH-CAP體系熒光增強(qiáng)的能力.

圖3(b)是AuNCs@GSH-CAP體系中加入BSA后的熒光強(qiáng)度差值與BSA濃度的關(guān)系圖，可以看出兩者是線性關(guān)系，其線性范圍10～160 μmol/L，線性方程F-F0=0.9536C+36.1372，R=0.974 98，其檢測限為0.1 μmol/L[9].

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2.3 AuNCs@GSH-CAP體系對BSA的選擇性

圖4 抗干擾檢測

2.4 檢測機(jī)理的研究

對AuNCs@GSH-CAP體系檢測BSA的檢測機(jī)理進(jìn)行研究，如圖5所示，在加入BSA后的AuNCs@GSH-CAP體系其吸收強(qiáng)度明顯增強(qiáng).而BSA對CAP的作用屬于靜態(tài)猝滅作用的特征，且反應(yīng)是自發(fā)的吸熱反應(yīng).對于藥物等有機(jī)小分子和蛋白質(zhì)等生物大分子常借助疏水作用力、氫鍵、Vander Waals力和靜電引力等相互結(jié)合形成超分子復(fù)合物，而CAP與BSA間的結(jié)合主要是氫鍵作用力和Vander Waals力，且在結(jié)合過程中產(chǎn)生了明顯的焓、熵負(fù)效應(yīng).因此使得AuNCs@GSH-CAP體系熒光強(qiáng)度增強(qiáng)[10].

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3 結(jié) 論

綜上所述，可以利用BSA使AuNCs@GSH-CAP體系熒光增強(qiáng)效果來檢測BSA，兩者在10～160 μmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其線性方程F-F0=0.9536C+36.1372，R=0.974 98，其檢測限為0.1 μmol/L.該熒光探針制備過程簡單、易操作、條件溫、響應(yīng)迅速、并且該探針相較于其他探針，具有良好的選擇性和抗干擾性，靈敏度高、檢測結(jié)果準(zhǔn)確且熒光效果明顯.在實(shí)驗(yàn)過程中取得良好的實(shí)驗(yàn)效果，具有較好的發(fā)展前景.