不同濃度黃芪多糖在SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)外抗氧化的研究

勞 軍，王楠楠

(吉林化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，吉林 吉林 132022)

黃芪(Astragalusmembranaceus)為豆科屬多年生草本植物，是較為常見(jiàn)的一種中草藥，其藥用部分為根部，由于含有多糖、皂苷及酚類等成分，因此可以用來(lái)保肝、抗氧化，刺激免疫系統(tǒng)和抗病毒等[1-2].其中黃芪多糖可以用來(lái)抗氧化自由基、降低血糖和延緩衰老.在黃芪中的多糖可以分為水溶性多糖和水不溶性多糖，而其水溶性多糖中含有葡萄糖、果糖以及半乳糖等，常用來(lái)止汗、抗腫瘤以及調(diào)節(jié)免疫等[3].目前關(guān)于黃芪的水溶性多糖的研究報(bào)道很多，而對(duì)其水溶性多糖在細(xì)胞內(nèi)的抗氧化活性研究較少.因此本文通過(guò)水提醇沉法提取黃芪水溶性多糖，用DPPH法研究其體外抗氧化活性，同時(shí)也用DCFH-DA法檢測(cè)了其在胞內(nèi)抗氧化活性，并進(jìn)一步用MTT法探索了其對(duì)H2O2損傷細(xì)胞模型的保護(hù)作用.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)用黃芪為市售，購(gòu)自于吉林大藥房，烘干后研磨成粉.無(wú)水乙醇(天津永大化學(xué)試劑公司)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(天津凱信化學(xué)試劑公司)、2,7-二氯二氫熒光素乙酰乙酯(DCF-DA)(蘇州宇恒生物科技有限公司)

實(shí)驗(yàn)所用儀器主要有紫外可見(jiàn)分光度計(jì)(TU-1901)、電熱恒溫干燥箱(DHG-9245A)、離心機(jī)(PDZ5-WS)、CO2培養(yǎng)箱(LS-C0150)、細(xì)胞成像微孔板檢測(cè)系統(tǒng)(170524B).

1.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程

(1)黃芪水溶性多糖的提取

采用水提醇沉淀法，稱取100 g黃芪粉，加適量的水定容于900 mL，水浴加熱至70 ℃.維持100 min之后，加300 ml 75%乙醇沉淀多糖物質(zhì)，3 000 rpm，離心10 min之后，所得沉淀即為黃芪粗多糖[4].

(2)DPPH法對(duì)不同濃度黃芪多糖清除自由基能力的測(cè)定

將上述黃芪多糖配成10、25、50、75、100 mg/mL的溶液，對(duì)照組加入50 μL水、2 mL DPPH溶液和 950 μL 95%乙醇；實(shí)驗(yàn)組分別加入不同濃度50 μL黃芪多糖溶液、2 mL DPPH溶液和950 μL 95%乙醇；混合后搖勻，靜止30 min.在分光光度計(jì)517 nm處測(cè)出每組的吸光度值代入如下公式[5]：

自由基的清除率=(A0-A)/A0 ×100%(A0代表對(duì)照組，A代表實(shí)驗(yàn)組)

從而計(jì)算出黃芪多糖對(duì)DPPH自由基的清除率

(3)H2O2對(duì)細(xì)胞損傷模型的建立及黃芪多糖對(duì)細(xì)胞活力作用的測(cè)定

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SH-SY5Y細(xì)胞按照每孔1×104均勻鋪到96孔板中，待細(xì)胞形態(tài)良好后，用0、6.25、12.5、25、50、100、200、400、800 μM H2O2和0、10、25、50、75、100 mg/mL黃芪多糖分別處理細(xì)胞，每個(gè)濃度和空白組設(shè)置三個(gè)復(fù)孔，處理24 h后，加入100 μL不完全培養(yǎng)基和10 μL 0.5 mg/mL MTT，在37 ℃恒溫CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min，在酶標(biāo)儀570 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)細(xì)胞的吸光度.

(4)黃芪多糖對(duì)H2O2處理的細(xì)胞ROS生成率的影響[6]

將DCFH-DA溶于甲醇中配成1 M的儲(chǔ)備液.取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SH-SY5Y細(xì)胞按照每孔1×104均勻鋪到96孔板中，待細(xì)胞形態(tài)良好后，以PBS洗滌細(xì)胞3次,加入200 μL0、10、25、50、75、100 mg/mL黃芪多糖溶液,于37 ℃ 下放置2 h，去除上清液，加入10 μL 0 μL不完全培養(yǎng)基，再加入H2O2終濃度為200 μM培養(yǎng)24 h之后，去除上清液，再加入95 μL的PBS和5 μL DCFH-DA,37 ℃孵育45 min,在酶標(biāo)儀上激發(fā)光488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm進(jìn)行檢測(cè).

(5)黃芪多糖對(duì)H2O2損傷細(xì)胞的保護(hù)作用測(cè)定

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的SH-SY5Y細(xì)胞按照每孔1×104均勻鋪到96孔板中，待細(xì)胞形態(tài)良好后，以PBS洗滌細(xì)胞3次,分別加入200 μL0、10、25、50、75、100 mg/mL黃芪多糖溶液,于37 ℃下對(duì)細(xì)胞分別預(yù)處理3、6和12 h之后，去除上清液，加入100 μL不完全培養(yǎng)基，再加入H2O2終濃度為200 μM培養(yǎng)24 h之后，用MTT檢測(cè)細(xì)胞活力，方法同上.

(6)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用Graphpad prism 7.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩組間分析使用t檢驗(yàn)，組間分析使用軟件進(jìn)行One-Way ANOVA分析，P<0.05說(shuō)明數(shù)據(jù)存在的差異性.

2 結(jié)果與討論

2.1 黃芪多糖在細(xì)胞外清除自由基的能力

在體外不同濃度的黃芪多糖對(duì)自由基的清除能力如圖1所示，在黃芪多糖濃度低于50 mg/mL時(shí)，隨著濃度不斷增加，對(duì)自由基的清除率也不斷升高；當(dāng)濃度達(dá)到50 mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)(72.3±1.7)%；濃度達(dá)100 mg/mL時(shí)，清除率可達(dá)(73.1±2.8)%，對(duì)自由基的清除率上升幅度不大，達(dá)到了一個(gè)平臺(tái)期.

黃芪多糖濃度/(mg·mL-1)

2.2 黃芪多糖在細(xì)胞內(nèi)的抗氧化結(jié)果

2.2.1 H2O2及黃芪多糖對(duì)細(xì)胞活力作用的測(cè)定

H2O2是一種強(qiáng)氧化劑,是最常用的建立細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生模型的試劑，進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)液后,會(huì)直接攻擊細(xì)胞上的蛋白質(zhì)、脂類,破壞膜系的完整性,從而造成細(xì)胞連續(xù)受損而壞死[7].本實(shí)驗(yàn)中,在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加入外源性的 H2O2,通過(guò)MTT法檢測(cè)H2O2對(duì)細(xì)胞活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2.

H2O2濃度/μM

圖2表明SH-SY5Y細(xì)胞經(jīng)H2O2處理后細(xì)胞活力明顯下降，表明細(xì)胞受到損傷或者部分已經(jīng)死亡，在12.5～800 μM濃度范圍內(nèi)，隨著H2O2濃度升高，細(xì)胞活力呈梯度下降，與對(duì)照組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，當(dāng)H2O2濃度為200 μM時(shí)細(xì)胞活力達(dá)到(55±1.52)%，與H2O2其它濃度的細(xì)胞活力相比之下較為適中，故選擇200 μM H2O2作為建立氧化損傷模型的最佳濃度.同時(shí)，通過(guò)MTT檢測(cè)了不同濃度的黃芪多糖對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響，如圖3所示，黃芪多糖對(duì)細(xì)胞活力的影響不大，隨著其濃度的升高，細(xì)胞活力略微下降，當(dāng)濃度達(dá)到100 mg/mL，細(xì)胞活力仍在95%以上.

黃芪多糖濃度/(mg·mL-1)

2.2.2 黃芪多糖細(xì)胞內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

DCFH-DA 是可穿透細(xì)胞的非熒光性物質(zhì),能夠被細(xì)胞中的ROS 所氧化.進(jìn)入細(xì)胞以后,經(jīng)過(guò)細(xì)胞的脂酶作用脫去二乙?；煞菬晒獾?′,7′-二氯氫化熒光素(DCFH),DCFH 被細(xì)胞內(nèi)的活性氧氧化以后生成發(fā)熒光的2′,7′-二氯熒光素(DCF),因此通過(guò)檢測(cè)熒光的強(qiáng)度可以判斷細(xì)胞的氧化程度[8].黃芪多糖對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的清除率結(jié)果如圖4所示，圖4表明用200 μM H2O2處理細(xì)胞，胞內(nèi)產(chǎn)生ROS.經(jīng)過(guò)黃芪多糖預(yù)處理的細(xì)胞，能夠清除胞內(nèi)的ROS；并且預(yù)處理的黃芩多糖濃度越大，對(duì)ROS自由基的清除率也增大.當(dāng)黃芪多糖濃度到達(dá)75 mg/mL時(shí)，對(duì)ROS自由基的清除率達(dá)到(53.33±5.24)%；而當(dāng)黃芪多糖濃度到達(dá)100 mg/mL時(shí)，對(duì)ROS自由基的清除率達(dá)到(53.67±2.33)%，對(duì)自由基清除率變化不大，從而達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期.

黃芪多糖濃度/(mg·mL-1)

2.2.3 黃芪多糖對(duì)H2O2損傷的SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響

為了考察黃芪多糖對(duì)H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞的活力作用情況，本文用黃芪多糖分別在0、10、25、50、75、100 mg/mL的濃度下，分別預(yù)處理SH-SY5Y細(xì)胞3 h、6 h和12 h之后，用H2O2作用SH-SY5Y細(xì)胞24 h之后，使用MTT檢測(cè)其細(xì)胞活力，結(jié)果見(jiàn)圖5.圖5表明在濃度75、100 mg/mL處理3 h后細(xì)胞活力均高于其他濃度和處理時(shí)間的細(xì)胞活力，其中濃度在75 mg/mL下細(xì)胞活力最高；兩者與其對(duì)照組相比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，表明對(duì)H2O2損傷的細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，這與黃芪多糖清除細(xì)胞內(nèi)活性氧結(jié)果相對(duì)應(yīng)，而其他濃度預(yù)處理3 h、6 h和12 h的細(xì)胞活力與其各自的對(duì)照組相比較，沒(méi)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)表明對(duì)細(xì)胞無(wú)保護(hù)作用，這可能是由于黃芪多糖長(zhǎng)時(shí)間處理細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一定的毒性.

黃芪多糖濃度/(mg·mL-1)

3 結(jié) 論

任何產(chǎn)生未成對(duì)電子的原子或原子團(tuán)就會(huì)成為自由基，而自由基在細(xì)胞內(nèi)會(huì)損壞一些重要的生物大分子，從而引起一系列的疾病[9-11].因此尋找一些抗氧化清除自由基的天然藥物很重要.在人體中，氧衍生的自由基是非常主要的自由基來(lái)源.例如超氧陰離子和羥基自由基[12]，通常統(tǒng)稱為活性氧(ROS)，H2O2是活性氧(ROS)的主要成分之一，可以跨膜擴(kuò)散進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)，是目前比較常用的細(xì)胞氧化應(yīng)激的誘導(dǎo)劑，常用來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的建立[13-14].現(xiàn)有的研究已經(jīng)證明，黃芪多糖具有一定的抗氧化能力，同時(shí)認(rèn)為在清除自由基方面高于公認(rèn)的維生素C[15]，在本文中黃芪多糖不僅能夠降低細(xì)胞內(nèi)的活性氧，而且能夠?qū)2O2氧化損傷的細(xì)胞具有一定的保護(hù)力，這說(shuō)明黃芪多糖具有開(kāi)發(fā)成抗氧化清除自由基藥物的潛力.

本試驗(yàn)對(duì)黃芪多糖在體外和細(xì)胞內(nèi)的抗氧化清除自由基的能力進(jìn)行了研究，研究表明黃芪多糖在體外抗氧化清除自由基的最佳濃度為75 mg/mL.在對(duì)H2O2損傷的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用研究中，發(fā)現(xiàn)75 mg/mL 作用3 h保護(hù)作用最佳.