野木瓜果汁非酶褐變抑制及營(yíng)養(yǎng)保全工藝優(yōu)化

崔霖蕓 羅洪波

(遵義醫(yī)藥高等專(zhuān)科學(xué)校，貴州 遵義 563006)

野木瓜是薔薇科木瓜屬植物，味酸性溫，具有舒筋活絡(luò)、和胃化濕的功效[1]?，F(xiàn)代科學(xué)研究[2]表明其果實(shí)富含多酚、多糖、黃酮、齊墩果酸及多種維生素等生物活性物質(zhì)。貴州省遵義市正安縣野木瓜因其優(yōu)良的品質(zhì)，于1996年被授予“中國(guó)野木瓜之鄉(xiāng)”的稱(chēng)號(hào)[3]。野木瓜作為第一批被列入藥食同源的中藥材，除了制成膠囊或片劑藥用外，還被加工成果汁、果脯、軟糖、果酒、果醋等食品，其中果汁是主要產(chǎn)品。

野木瓜果汁在貯藏過(guò)程中容易發(fā)生非酶褐變，造成產(chǎn)品品質(zhì)與營(yíng)養(yǎng)價(jià)值降低。因?yàn)榉敲负肿兊姆磻?yīng)類(lèi)型多樣，加工過(guò)程中常用復(fù)合抑制劑，發(fā)揮其不同類(lèi)型的抑制協(xié)同作用抑制褐變。如李鵬等[4]發(fā)現(xiàn)0.02%的L-半胱氨酸、0.2%的D-異抗壞血酸鈉和0.01%的亞硫酸氫鈉復(fù)合抑制劑能有效抑制柿子汁的非酶褐變；常大偉等[5]發(fā)現(xiàn)0.10%抗壞血酸、0.4%β-環(huán)糊精和0.08% EDTA對(duì)渾濁型梨汁的褐變有較好抑制作用等。而加工中常使用的EDTA及含硫化合物雖然對(duì)褐變的抑制效果較好，但不利于身體健康。目前野木瓜果汁非酶褐變抑制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

研究擬以野木瓜果汁非酶褐變抑制率為主要響應(yīng)目標(biāo)，將多酚保全率(即抑制褐變后的多酚含量與鮮果汁多酚含量的百分比)和·OH清除率作為次響應(yīng)目標(biāo)，應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)褐變抑制劑的種類(lèi)及濃度進(jìn)行工藝優(yōu)化，以期為提高野木瓜果汁的加工技術(shù)水平提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

野木瓜：貴州省遵義市正安縣；

L-半胱氨酸、植酸、D-異抗壞血酸鈉：食品級(jí)，純度99%，上海阿達(dá)瑪斯有限公司；

檸檬酸、NaCl、CaCl2：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

福林酚：生化級(jí)，北京索萊寶科技有限公司；

碳酸鈉、FeSO4、水楊酸、H2O2：化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

分光光度計(jì)：UV-1801型，北京北分瑞利分析儀器有限公司；

榨汁機(jī)：JYZ-V902型，山東九陽(yáng)股份有限公司;

微波爐：WD900TL23型，廣東順德格蘭仕微波爐有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

野木瓜鮮果→挑選→清洗→去皮核切塊(1 cm3)→1% NaCl浸泡(5 min)→1.5% NaCl漂燙(100 ℃，30 s)→微波滅酶(800 W，50 s)→榨汁→過(guò)濾(100目沙布)→離心(4 000 r/min，3 min取上清液)→添加抑制劑→殺菌(100 ℃，60 s)→趁熱裝瓶→成品

1.2.2 褐變抑制率的測(cè)定 在420 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定樣品的吸光度值，以A420 nm值表示該樣品的褐變指數(shù)[6]。按式(1)計(jì)算褐變抑制率。

I=[(Ai-A0)/A0]×100%，

(1)

式中：

I——褐變抑制率，%；

Ai——添加抑制劑的褐變指數(shù)；

A0——未添加抑制劑的褐變指數(shù)。

1.2.3 多酚保全率的測(cè)定 采用福林法測(cè)定多酚含量[7]，按式(2)計(jì)算多酚保全率。

P=[(Ci-C0)/C0]×100%，

(2)

式中：

P——多酚保全率，%；

Ci——抑制褐變后果汁中多酚濃度，μg/mL；

C0——鮮果汁中多酚濃度，μg/mL。

1.2.4 ·OH清除率的測(cè)定 采用Fenton法[8]，按式(3)計(jì)算·OH清除率。

R=[(A0-Ax)/A0]×100%，

(3)

式中：

R——清除率，%；

A0——空白對(duì)照的吸光度值；

Ax——加入待測(cè)液后的吸光度值。

1.2.5 單因素試驗(yàn) 據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[5,9-10]及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選定檸檬酸、氯化鈣、D-異抗壞血酸鈉、氯化鈉、植酸、L-半胱氨酸6種抑制劑，以褐變抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考察單一褐變抑制劑的抑制作用。每種抑制劑設(shè)置5個(gè)濃度梯度[檸檬酸、氯化鈣、D-異抗壞血酸鈉、氯化鈉、植酸分別設(shè)定(添加劑在果汁中的質(zhì)量濃度)0.01%，0.05%，0.10%，0.30%，0.50% 5個(gè)梯度，L-半胱氨酸設(shè)定0.05%，0.10%，0.40%，0.70%，1.00% 5個(gè)梯度]，每次試驗(yàn)只添加一種抑制劑的一個(gè)濃度，不添加其他抑制劑，以考察每種抑制劑的添加量對(duì)野木瓜果汁非酶褐變的抑制作用。

1.2.6 Plackett-Burman試驗(yàn) 以野木瓜果汁褐變度為考察指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)確定的檸檬酸、氯化鈣、D-異抗壞血酸鈉、氯化鈉、L-半胱氨酸、植酸的濃度為考察對(duì)象，選擇n=12的2水平PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.2.7 最陡爬坡試驗(yàn) 根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果篩選出的因素和效應(yīng)方向，確定爬坡試驗(yàn)因素、步長(zhǎng)和爬坡方向，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)方案。

1.2.8 Box-Behnken試驗(yàn) 根據(jù)PB試驗(yàn)和爬坡試驗(yàn)選出的顯著因素與水平，應(yīng)用Design Expert 8.0軟件，設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn)。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 所有試驗(yàn)均重復(fù)進(jìn)行3次，取平均值。采用t檢驗(yàn)判斷數(shù)據(jù)顯著性。在P<0.05水平設(shè)置數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異，采用Excel和Design-Expert 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與討論

2.1 單一抑制劑對(duì)野木瓜果汁褐變的影響

由圖1可知，D-異抗壞血酸鈉和檸檬酸的抑制效果均隨濃度的增加而明顯增加，但在濃度達(dá)到0.10%以后，其抑制作用趨于穩(wěn)定，在0.3%后隨濃度增加抑制下降，D-異抗壞血酸鈉的抑制作用主要是由其在酸性環(huán)境中易分解出D-異抗壞血酸[11]，高濃度下抑制效果增加較小甚至下降，可能是因其在高濃度下自身氧化褐變反應(yīng)加快所致，因此在PB試驗(yàn)中將其濃度水平定為0.05%～0.10%。檸檬酸的抑制效果隨濃度的增加有明顯增加，但在濃度達(dá)到0.10%以后，其抑制效果增加趨于平緩，檸檬酸對(duì)非酶褐變的抑制可能是通過(guò)降低體系的pH值[7]，此外，檸檬酸有3個(gè)羧基，能有效絡(luò)合體系中的銅、鐵等金屬離子，研究[8]顯示金屬離子會(huì)降低果汁氧化還原電位進(jìn)而促進(jìn)褐變，高濃度下抑制效果增加平緩則可能是因其絡(luò)合作用使果汁中金屬離子迅速減少，因此在PB試驗(yàn)中將其濃度水平定為0.05%～0.10%。植酸在低濃度下具有較高褐變抑制率，但隨著濃度增加，抑制率反而降低，植酸的抑制作用可能源于其還原性(能提供6對(duì)氫原子與自由基電子形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu))[12]和6個(gè)螯合金屬離子的磷酸根基團(tuán)，其抑制率隨著濃度的增加而下降可能是由于野木瓜果汁中金屬離子較少，植酸在低濃度下就基本螯合完全，此外植酸濃度的增加使果汁pH值下降，促進(jìn)抗壞血酸的氧化褐變，有研究[13]顯示在pH值<3.0時(shí)，抗壞血酸的氧化褐變隨pH值的下降而上升，因此在PB試驗(yàn)中將其濃度水平定為0.03%～0.06%。氯化鈣的抑制作用隨濃度增加緩慢增加，在濃度達(dá)到0.05%后隨著濃度的增加而緩慢下降，氯化鈣的抑制作用主要是通過(guò)鈣離子與氨基酸結(jié)合形成不溶性化合物，從而抑制美拉德褐變反應(yīng)[14]，氯化鈣的抑制作用隨濃度緩慢增加可能是因?yàn)橐澳竟瞎瓋?nèi)氨基酸含量較低，鈣離子作用有限，另外氯化鈣在較高濃度下促進(jìn)抗壞血酸螯合金屬陽(yáng)離子而消耗抗壞血酸，使褐變抑制率降低[15]，因此在PB試驗(yàn)中將其濃度水平定為0.05%～0.10%。氯化鈉的抑制作用隨濃度的增加先增加后下降，可能是氯化鈉在去除野木瓜果汁澀味的同時(shí)，消耗了褐變反應(yīng)物而抑制褐變，此外還能降低果汁內(nèi)的氧含量，從而降低氧化反應(yīng)速度而抑制褐變；在較高濃度下氯化鈉也能促進(jìn)抗壞血酸螯合金屬陽(yáng)離子而消耗抗壞血酸，使褐變抑制率降低[15]，因此在PB試驗(yàn)中將其濃度水平定為0.05%～0.10%。

圖1 檸檬酸等5種抑制劑對(duì)野木瓜果汁褐變的影響Figure 1 Effects of citric acid and other factors on the browning of Stanuntonia chinensis juice

由圖2可知，L-半胱氨酸對(duì)野木瓜果汁褐變具有很強(qiáng)的抑制作用，是試驗(yàn)所選6個(gè)抑制劑中抑制效果最好的。濃度僅為0.05%即可達(dá)到30.7%的抑制率，且隨濃度增加而迅速增加，濃度為0.40%時(shí)抑制率達(dá)到59.5%，隨后增加放緩，在濃度達(dá)0.70%后趨于平緩。L-半胱氨酸的抑制效果源于其具有—SH，—SH可以與酚類(lèi)化合物的氧化產(chǎn)物醌類(lèi)物質(zhì)形成無(wú)色的羥醌類(lèi)化合物，從而抑制酚類(lèi)的非酶褐變反應(yīng)[16]，因?yàn)榘腚装彼嶂械膸€基硫原子極化形成的空d軌道重疊后親核作用增強(qiáng)，在親核加成反應(yīng)中—SH反應(yīng)速率比—NH2高200～300倍，使得羰基化合物先與—SH加成從而抑制褐變[17]。鑒于單因素試驗(yàn)中L-半胱氨酸濃度為0.70%以后，褐變抑制率增加幅度變緩，PB試驗(yàn)濃度取值為0.40%～0.80%。

圖2 L-半胱氨酸對(duì)野木瓜果汁褐變的影響Figure 2 Effects of L-cysteine on the browning of Stanuntonia chinensis juice

2.2 PB試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果所確定的PB試驗(yàn)方案見(jiàn)表1，表中G、H、J、K、L列為虛擬列，用于估計(jì)試驗(yàn)誤差。表2為PB試驗(yàn)數(shù)據(jù)的模型方差分析。

表1 Plackett-Burman試驗(yàn)方案

用Design-Expert 8.0軟件對(duì)表1試驗(yàn)因子進(jìn)行顯著性分析，得回歸方程(編碼方程)為：

R=63.581+0.618A-2.613B+0.134C-0.893D-1.406E+3.741F。

(4)

由表2可知，回歸模型P=0.004 4，極顯著，說(shuō)明該回歸方程在回歸區(qū)域擬合極好。選取P<0.05的因素，即植酸、D-異抗壞血酸鈉和L-半胱氨酸對(duì)結(jié)果影響顯著的3個(gè)因素。由回歸方程可知，B、E系數(shù)為負(fù)，即植酸和D-異抗壞血酸鈉為負(fù)效應(yīng)(即低水平影響大，爬坡試驗(yàn)向下取值)，L-半胱氨酸為正效應(yīng)(即高水平影響大，爬坡試驗(yàn)向上取值)。

2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

由表2可知，植酸為負(fù)效應(yīng)，為便于操作，以步長(zhǎng)0.005% 向下取值；D-異抗壞血酸鈉為負(fù)效應(yīng)，向下取值，為便于操作，步長(zhǎng)取0.01%；L-半胱氨酸為正效應(yīng)，向上取值，為便于操作，以步長(zhǎng)0.10%向上取值，最陡爬坡試驗(yàn)方案及結(jié)果見(jiàn)表3。

表2 Plackett-Burman試驗(yàn)ANOVA分析

由表3可知，隨著3個(gè)顯著因素的變化，野木瓜果汁褐變抑制率呈先增加后減少，最優(yōu)抑制配比出現(xiàn)在試驗(yàn)條件5的最佳響應(yīng)值區(qū)域。

表3 最陡爬坡試驗(yàn)方案及結(jié)果

2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)爬坡試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用Box-Behnken設(shè)計(jì)法，以植酸0.015%、D-異抗壞血酸鈉0.05%、L-半胱氨酸0.90%為中心點(diǎn)，以野木瓜果汁褐變抑制率(權(quán)重為0.75)為主響應(yīng)值、多酚保全率(權(quán)重為0.125)、對(duì)羥自由基的清除率(權(quán)重為0.125)為次響應(yīng)值加權(quán)計(jì)算的綜合指標(biāo)為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)了三因素三水平的響應(yīng)面擬合試驗(yàn)方案見(jiàn)表4，結(jié)果見(jiàn)表5。

表4 Box-Behnken試驗(yàn)方案

通過(guò)Design Expert 8.0軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得以下二次多項(xiàng)式方程(代碼方程)：

AI=79.53+0.403A+2.29B-0.50C-0.60AB+0.14AC+0.93BC-1.45A2-1.64B2-0.96C2(R2=0.979 4)。

(5)

擬合方程R2>0.95，說(shuō)明該方程擬合良好。由表6可知，回歸模型P<0.000 1，極顯著，說(shuō)明方程模擬很好。從各因素看，L-半胱氨酸對(duì)綜合指標(biāo)達(dá)極顯著(P<0.01)，植酸和D-異抗壞血酸鈉對(duì)綜合指標(biāo)均達(dá)顯著水平(P<0.05)，說(shuō)明這3個(gè)因素對(duì)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)作用顯著。

表6 綜合指標(biāo)方差分析表?

圖3為綜合指標(biāo)的等高線圖和三維響應(yīng)面圖。由圖3(a) 可知，植酸和L-半胱氨酸的等高線圖近似橢圓，說(shuō)明交互作用顯著[18]。植酸的等高線圖為U形，說(shuō)明植酸在濃度較低時(shí)，對(duì)綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)有正效應(yīng)，但在高濃度時(shí)，隨植酸濃度的增加，要達(dá)到相同的綜合指標(biāo)值，需要增加L-半胱氨酸濃度，說(shuō)明植酸在高濃度時(shí)對(duì)綜合指標(biāo)有負(fù)效應(yīng)，與PB試驗(yàn)結(jié)果相符。由圖3(c)可知，植酸和D-異抗壞血酸鈉的等高線圖近似圓形，說(shuō)明交互作用不顯著，而且植酸和D-異抗壞血酸鈉在濃度較低時(shí)對(duì)綜合指標(biāo)有較好的作用，高濃度時(shí)二者均需要增加濃度才能維持相同的綜合指標(biāo)水平，可能是因?yàn)殡S濃度的增加，D-異抗壞血酸鈉自身氧化褐變反應(yīng)增強(qiáng)[19]，而植酸濃度的增加降低了果汁pH值而促進(jìn)抗壞血酸的氧化褐變。由圖3(e)可知，D-異抗壞血酸鈉與L-半胱氨酸等高線圖近似橢圓，說(shuō)明交互作用顯著。D-異抗壞血酸鈉的等高線圖是向右上方傾斜的，即隨D-異抗壞血酸鈉濃度的增加，要維持同一綜合指標(biāo)水平，需要增加L-半胱氨酸濃度，說(shuō)明D-異抗壞血酸鈉在較低濃度下有較好的抑制效果，與前面結(jié)果吻合。

通過(guò)Design Expert 8.0軟件，得到最優(yōu)褐變抑制配方為L(zhǎng)-半胱氨酸 0.972%、D-異抗壞血酸鈉0.051%、植酸0.015%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù))，此條件下，綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)為80.33。

為了驗(yàn)證回歸模型的準(zhǔn)確度與有效性，按以上抑制劑的最優(yōu)復(fù)合配制條件(為實(shí)際操作方便，取L-半胱氨酸 0.97%、D-異抗壞血酸鈉0.05%、植酸0.015%)，進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)際檢測(cè)抑制率為81.39%，多酚保全率為85.76%，·OH清除率為63.61%，綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)為80.27，實(shí)驗(yàn)值與驗(yàn)證值的誤差為0.07%，說(shuō)明回歸模型較好擬合了最優(yōu)配方的抑制實(shí)驗(yàn)。

圖3 綜合指標(biāo)的等高線及響應(yīng)面圖Figure 3 Contour line and response surface diagram of aggregative indictor

3 結(jié)論

通過(guò)應(yīng)用 PB試驗(yàn)選出單因素試驗(yàn)中的顯著效應(yīng)抑制劑和爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)等方法，確定野木瓜汁的最佳復(fù)配抑制劑配方為：L-半胱氨酸 0.97%、D-異抗壞血酸鈉0.05%、植酸0.015%。該優(yōu)化條件下實(shí)測(cè)的褐變抑制率可達(dá)81.39%，多酚保全率為85.76%，·OH清除率為63.61%。

研究雖然證實(shí)不使用亞硫酸鹽和EDTA，只用較低濃度且對(duì)人體無(wú)害的抑制劑就可達(dá)到較好的褐變抑制效果，并能夠較好地保全野木瓜果汁的多酚成分和·OH清除功效，但仍需要進(jìn)一步通過(guò)果汁的貯藏試驗(yàn)確定在貯藏過(guò)程中的非酶褐變抑制效果，同時(shí)對(duì)野木瓜果汁主要成分在褐變中的作用及其反應(yīng)底物進(jìn)行研究。在果汁營(yíng)養(yǎng)保全方面還需對(duì)果汁中的其他主要營(yíng)養(yǎng)成分如氨基酸、多糖等的變化進(jìn)行研究，并全面測(cè)試其抗氧化功效。