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    lncRNA XIST靶向miR-410對(duì)谷氨酸誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷的調(diào)控機(jī)制研究

    2020-10-17 09:12:26王麗純舒寶童馬宇劉意
    眼科新進(jìn)展 2020年10期
    關(guān)鍵詞:神經(jīng)細(xì)胞熒光素酶視網(wǎng)膜

    王麗純 舒寶童 馬宇 劉意

    視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷可引發(fā)視神經(jīng)功能障礙。缺血性腦出血、糖尿病、缺氧等誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)可促使視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷,最終導(dǎo)致視功能喪失[1]。因此,基于視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷機(jī)制尋找相關(guān)分子標(biāo)志物有助于防治視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷。長(zhǎng)鏈非編碼RNA-X染色體失活特異轉(zhuǎn)錄物(long non-coding RNA X-inactive specific transcript,lncRNA XIST)屬于內(nèi)源性非編碼RNA,可促進(jìn)神經(jīng)元凋亡[2]。XIST高表達(dá)可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡[3],XIST還可調(diào)控骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡[4]。但XIST在視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷中的調(diào)控機(jī)制尚未闡明。靶基因預(yù)測(cè)軟件starBase預(yù)測(cè)顯示,微小RNA-410(microRNA-410,miR-410)可能是XIST的靶基因。研究表明,缺血性腦卒中患者中miR-410過表達(dá)對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用[5]。相關(guān)報(bào)道指出,核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf-2)信號(hào)通路激活可發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用從而減輕組織損傷[6]。但XIST是否通過調(diào)控miR-410及Nrf-2信號(hào)通路而影響視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷尚未可知。谷氨酸(glutamic acid,Glu)屬于視網(wǎng)膜興奮性神經(jīng)遞質(zhì),可促使神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,還可促使視網(wǎng)膜缺血、缺氧及糖尿病視網(wǎng)膜病變等視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷及凋亡[7]。因此,本研究采用Glu誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型,探討沉默XIST對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響,分析其對(duì)miR-410的調(diào)控作用,初步探究其可能作用機(jī)制,為視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)及相關(guān)疾病藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料SPF級(jí)健康SD小鼠10只, 3~5 d 齡,購(gòu)自上海凱學(xué)生物科技有限公司,動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(滬):2016-0008。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;Lipofectamine2000購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;Glu購(gòu)自美國(guó)Amresco公司;lncRNA XIST小干擾RNA(si-lncRNA XIST)、亂序無意義陰性序列(si-con)、miR-410模擬物(mimics)、陰性對(duì)照(miR-con)、miR-410特異性寡核苷酸抑制劑 (anti-miR-410)、陰性對(duì)照(anti-miR-con)均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司;Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒均購(gòu)自日本TaKaRa公司;膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;細(xì)胞核蛋白提取試劑盒與總蛋白提取試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)羅氏公司;兔抗鼠活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved Caspase-3)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(Cleaved Caspase-9)抗體與辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗均購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司;兔抗鼠Nrf-2、NADH 脫氫酶 1(NQO1)、血紅素氧合酶 1(HO-1)抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

    1.2 方法

    1.2.1 原代培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞參照文獻(xiàn)[8]原代培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞,具體步驟為:頸椎脫臼法處死小鼠,取眼球后去除角膜、晶狀體及玻璃體,分離出視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮層,剪碎,用12.5 g·L-1胰蛋白酶與2 g·L-1透明質(zhì)酸酶(11)消化,置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)消化20 min,使用加含有體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的培養(yǎng)基終止消化,4 ℃條件下800 r·min-1離心5 min,棄上清,加入含有體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)液,用200目無菌篩網(wǎng)過濾,收集細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度為100個(gè)·mL-1,按每孔150 μL接種于24孔板,于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,加入阿糖胞苷(10 mg·L-1),每隔3 d更換一次培養(yǎng)液。

    1.2.2 Glu處理及實(shí)驗(yàn)分組收集培養(yǎng)7 d的原代小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞,參照文獻(xiàn)[9]選用20 μmol·L-1的Glu分別處理視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞0 h、6 h、12 h、24 h、48 h,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率,篩選Glu適宜作用時(shí)間用于后續(xù)研究。

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞,加入20 μmol·L-1的Glu處理24 h,記作Glu組。同時(shí)將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為NC組。將si-con、si-lncRNA XIST、pcDNA和pcDNA-lncRNA XIST轉(zhuǎn)染至視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞,分別記作si-con組、si-lncRNA XIST組、pcDNA組和pcDNA-lncRNA XIST組;將si-con、si-lncRNA XIST、miR-con、miR-410 mimics、si-lncRNA XIST與anti-miR-con、si-lncRNA XIST與anti-miR-410轉(zhuǎn)染至視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞,隨后使用20 μmol·L-1的Glu處理24 h,分別記作Glu+si-con組、Glu+si-lncRNA XIST組、Glu+miR-con組、Glu+miR-410組、Glu+si-lncRNA XIST+anti-miR-con組、Glu+si-lncRNA XIST+anti-miR-410組。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)9次或每組設(shè)9個(gè)復(fù)孔。

    1.2.3 檢測(cè)LDH活性收集各組細(xì)胞,根據(jù)LDH活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組LDH活性,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

    1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集各組細(xì)胞,加入2.5 g·L-1胰蛋白酶消化,調(diào)整細(xì)胞密度至 10×103個(gè)·mL-1,預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞,4 ℃條件下經(jīng)1000 r·min-1離心5 min(離心半徑6 cm),收集細(xì)胞沉淀至流式管內(nèi),加入500 μL Binding Buffer重懸細(xì)胞,分別加入5 μL Annexin V-FITC,混勻,加入5 μL PI,混勻,室溫避光孵育20 min,置于FACS Calibur流式細(xì)胞儀及應(yīng)用Cellauest軟件檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。

    1.2.5 qRT-PCR檢測(cè)XIST、miR-410表達(dá)參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染,轉(zhuǎn)染48 h后收集各組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞,采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,按照反轉(zhuǎn)錄說明書將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。XIST正向引物:5’-CAGACGTGTGCTCTTC-3’,反向引物:5’-CGATCTGTAAGTCCACCA-3’;β-actin正向引物:5’-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3’,反向引物:5’-TGATGTCACGCACGATTT-3’;miR-410正向引物:5’-TAACACTGTCTGGTAACGATGT-3’,反向引物:5’-CATCTTACCGGACAGTGCTGGA-3’;U6正向引物:5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,反向引物:5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。引物均由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計(jì)合成。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),反應(yīng)體系:SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL,cDNA 2 μL,上下游引物各0.8 μL,ROX Reference Dye(50×)0.4 μL,ddH2O 6.0 μL;反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火60 s,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。XIST以β-actin為內(nèi)參,miR-410以U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計(jì)算XIST、miR-410相對(duì)表達(dá)量。

    1.2.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)lncRNA XIST與miR-410的靶向調(diào)控關(guān)系靶基因預(yù)測(cè)軟件starBase預(yù)測(cè)顯示,lncRNA XIST的序列中含有與miR-410互補(bǔ)的核苷酸序列,將結(jié)合位點(diǎn)序列插入熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建野生型報(bào)告基因載體WT-lncRNA XIST,利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變,同時(shí)將突變的結(jié)合位點(diǎn)插入熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建突變型報(bào)告基因載體MUT-lncRNA XIST,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞,分別將WT-lncRNA XIST、MUT-lncRNA XIST與miR-con、miR-410 mimics共轉(zhuǎn)染至視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞,分別命名為miR-con組與miR-410組,繼續(xù)培養(yǎng)48 h,檢測(cè)各組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性。

    1.2.7 Western blot檢測(cè)收集各組細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞核蛋白與總蛋白提取試劑盒分別提取細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞總蛋白,采用BCA法測(cè)定蛋白濃度, SDS-PAGE分離蛋白,將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜,室溫條件下采用50 g·L-1脫脂奶粉封閉2 h,分別加入Cleaved Caspase-3(1800)、Cleaved Caspase-9(1800)、Nrf-2(1500)、HO-1(1500)、NQO1(1500)一抗,4 ℃孵育過夜,TBST洗滌,加入二抗稀釋液(13000),室溫孵育1 h,TBST洗滌,滴加增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence,ECL)顯影,應(yīng)用Image J軟件分析各條帶灰度值。

    2 結(jié)果

    2.1 Glu誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡的影響隨著Glu誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.01),細(xì)胞凋亡蛋白Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表達(dá)水平均顯著升高(均為P<0.01),LDH活性顯著升高(P<0.01),其中Glu誘導(dǎo)24 h、48 h時(shí)顯著高于其他時(shí)間點(diǎn)(均為P<0.05),而Glu誘導(dǎo)24 h與48 h之間作用效果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05),因而后續(xù)研究使用的Glu誘導(dǎo)時(shí)間為24 h(見圖1、表1)。

    圖1 Western blot檢測(cè)Glu誘導(dǎo)不同時(shí)間視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)

    表1 Glu誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞LDH活性、細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

    2.2 Glu誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞lncRNA XIST和miR-410表達(dá)的影響隨著Glu誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng),視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中l(wèi)ncRNA XIST的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01),miR-410的表達(dá)水平顯著降低(P<0.01),其中Glu誘導(dǎo)24 h、48 h時(shí)顯著差異于其他時(shí)間點(diǎn)(均為P<0.05),而Glu誘導(dǎo)24 h與48 h之間表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(見表2)。

    表2 Glu誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞lncRNA XIST和miR-410表達(dá)的影響

    2.3 沉默lncRNA XIST抑制Glu誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡與NC組比較,Glu組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、LDH活性及Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05);與Glu+si-con組比較,Glu+si-lncRNA XIST組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、LDH活性及Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見圖2和表3)。

    圖2 Western blot檢測(cè)NC組、Glu組、Glu+si-con組、Glu+si-lncRNA XIST組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)

    表3 沉默lncRNA XIST對(duì)Glu誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞LDH活性、細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的影響 )

    2.4 lncRNA XIST靶向調(diào)控miR-410的表達(dá)靶基因預(yù)測(cè)軟件starBase預(yù)測(cè)顯示,lncRNA XIST與miR-410存在互補(bǔ)序列(見圖3)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染野生型報(bào)告基因載體WT-lncRNA XIST的細(xì)胞中,miR-410組熒光素酶活性為0.54±0.06,顯著低于miR-con組的1.00±0.09(P<0.05);轉(zhuǎn)染突變型報(bào)告基因載體MUT-lncRNA XIST的細(xì)胞中,miR-410組(1.23±0.14)與miR-con組(1.19±0.11)熒光素酶活性相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與si-con組(1.03±0.11)相比,si-lncRNA XIST組(4.28±0.49)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中miR-410的表達(dá)水平顯著升高(P<0.05);與pcDNA組(0.98±0.12)相比,pcDNA-lncRNA XIST組(0.54±0.08)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中miR-410的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

    圖3 lncRNA XIST與miR-410存在互補(bǔ)序列

    2.5 過表達(dá)miR-410抑制Glu誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡與Glu+miR-con組比較,Glu+miR-410組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、LDH活性及Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)(見圖4和表4)。

    圖4 Western blot檢測(cè)Glu+miR-con組和Glu+miR-410組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)

    表4 轉(zhuǎn)染miR-410對(duì)Glu誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞LDH活性、細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的影響

    2.6 干擾miR-410部分逆轉(zhuǎn)沉默lncRNA XIST抑制的Glu誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷和凋亡相較于Glu+si-lncRNA XIST+anti-miR-con組,Glu+si-lncRNA XIST+anti-miR-410組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡率、LDH活性及Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.01)(見圖5和表5)。

    圖5 Western blot檢測(cè)Glu+si-lncRNA XIST+anti-miR-con組和Glu+si-lncRNA XIST+anti-miR-410組細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)

    表5 轉(zhuǎn)染anti-miR-410部分逆轉(zhuǎn)沉默lncRNA XIST對(duì)Glu誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞LDH活性、細(xì)胞凋亡率及Cleaved Caspase-3和Cleaved Caspase-9蛋白表達(dá)的影響 )

    2.7 lncRNA XIST對(duì)Glu誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞Nrf-2信號(hào)通路的影響與NC組相比,Glu組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中Nrf-2、HO-1、NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05);與Glu+si-con組相比,Glu+si-lncRNA XIST組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中Nrf-2、HO-1、NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05);與 Glu+si-lncRNA XIST+anti-miR-con組相比,Glu+si-lncRNA XIST+anti-miR-410組視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中Nrf-2、HO-1、NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)(見圖6和表6)。

    圖6 Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中Nrf-2、HO-1和NQO1蛋白表達(dá)

    表6 lncRNA XIST對(duì)Glu誘導(dǎo)視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞Nrf-2、HO-1和NQO1蛋白表達(dá)的影響

    3 討論

    lncRNA可通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA從而參與視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生發(fā)展過程。研究表明,miRNA在視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中異常表達(dá)并可能參與缺血缺氧性視網(wǎng)膜病變的發(fā)生過程[10-12]。因而,積極探尋新型分子標(biāo)志物可為視網(wǎng)膜損傷治療藥物的研發(fā)提供新思路。

    本研究結(jié)果顯示,Glu誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和LDH活性顯著升高。研究表明,沉默lncRNA XIST可通過調(diào)節(jié)miR-449抑制急性心肌梗死大鼠的心肌細(xì)胞凋亡[13]。急性肺炎時(shí)抑制XIST可通過靶向miR-370-3p/TLR4而減輕內(nèi)毒素誘導(dǎo)的WI-38細(xì)胞凋亡及炎癥損傷[14]。本研究結(jié)果與鮑月寧等[15]研究結(jié)果相似,提示成功構(gòu)建視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷模型,Glu誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中l(wèi)ncRNA XIST的表達(dá)水平顯著升高,沉默lncRNA XIST后視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著降低,LDH活性顯著降低,提示沉默lncRNA XIST可抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡及減輕炎癥損傷。本研究結(jié)果顯示,沉默lncRNA XIST后視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9表達(dá)水平顯著降低,與馬偉等[16]研究結(jié)果相似,提示沉默lncRNA XIST可能通過下調(diào)Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9的表達(dá)而抑制線粒體途徑活化,進(jìn)而抑制視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡。

    本研究通過雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)與qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí),lncRNA XIST可靶向結(jié)合miR-410并可抑制miR-410的表達(dá)。miR-410通過PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)大鼠的七氟醚麻醉誘導(dǎo)的認(rèn)知功能障礙發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[17]。miR-410通過抑制PTEN/AKT/mTOR信號(hào)通路,在6-羥基多巴胺誘導(dǎo)的帕金森病細(xì)胞模型中發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[18]。本研究結(jié)果顯示,Glu誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中miR-410的表達(dá)水平明顯降低,miR-410過表達(dá)后視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡率和LDH活性顯著降低,Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白的相對(duì)表達(dá)量也均明顯降低,提示miR-410過表達(dá)可抑制Glu誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡及減輕氧化應(yīng)激損傷。本研究結(jié)果還顯示,干擾miR-410表達(dá)聯(lián)合沉默lncRNA XIST處理后,Glu誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯升高,LDH活性明顯增強(qiáng),Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著升高,提示沉默lncRNA XIST可能通過上調(diào)miR-410的表達(dá)從而減輕Glu誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞損傷。

    Nrf-2信號(hào)通路是一種抗氧化通路,正常生理?xiàng)l件下,Nrf-2位于細(xì)胞質(zhì)且與Keap1蛋白結(jié)合;當(dāng)細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)Nrf-2與Keap1分離,Nrf-2進(jìn)入細(xì)胞核并激活下游HO-1、NQO1,從而增強(qiáng)細(xì)胞抗氧化應(yīng)激能力[19-20]。本研究結(jié)果顯示,Glu誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中Nrf-2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)水平均顯著降低,說明Glu可抑制Nrf-2信號(hào)通路激活;沉默lncRNA XIST后Nrf-2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)水平均顯著升高,而干擾miR-410后Nrf-2、HO-1、NQO1蛋白表達(dá)水平均顯著降低,提示沉默lncRNA XIST可能通過上調(diào)miR-410表達(dá)而激活Nrf-2信號(hào)通路,從而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用。

    綜上所述,lncRNA XIST在Glu誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中呈高表達(dá),而miR-410表達(dá)下調(diào),沉默lncRNA XIST可能通過上調(diào)miR-410的表達(dá)從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡及減輕細(xì)胞損傷,且其可能是通過激活Nrf-2信號(hào)通路而發(fā)揮作用的。本研究結(jié)果可為缺血缺氧性視網(wǎng)膜疾病的防治提供新方向。

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