血漿ctDNA檢測在結(jié)直腸癌診療中的應(yīng)用

陳馨寧，鄔升超，郭 瑋，王蓓麗

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032）

結(jié)直腸癌全球發(fā)病率和死亡率分別居第3位和第4位[1]。結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展被認(rèn)為是由環(huán)境因素以及遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)的積累所導(dǎo)致的[2]。常見結(jié)直腸癌治療方式有手術(shù)切除、放療、化療以及分子靶向治療[3]。在常見治療手段中，分子靶向治療由于其較低的毒性反應(yīng)、更強的靶向性、更好的療效，在結(jié)直腸癌治療中獲得更多關(guān)注。在臨床制定治療策略前，通常推薦對腫瘤原發(fā)灶及轉(zhuǎn)移灶進行活檢，然而由于受制于取樣差異、腫瘤異質(zhì)性、無法反復(fù)多次取樣[4]以及其創(chuàng)傷性等缺點，越來越多的研究者將注意力放在了能夠彌補組織活檢不足的液體活檢上[5-7]。

1 液體活檢與ctDNA

不同于腫瘤組織活檢，液體活檢是針對患者體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)的一類非侵入性病理檢測方法。液體活檢操作簡便、無創(chuàng)、實時，可多次實施，具有替代傳統(tǒng)活檢的潛質(zhì)[8]。液體活檢在未來醫(yī)學(xué)的早期診斷、治療選擇、預(yù)后監(jiān)測、療程指導(dǎo)等領(lǐng)域都具有巨大的潛力。很多體液，如血液、尿液、腦脊液等都可以作為液體活檢的標(biāo)本，其中從血液中分離出的一系列物質(zhì)經(jīng)過分子分析可以得到獨特的、補充性的信息[7]。根據(jù)診斷標(biāo)志物種類將液體活檢領(lǐng)域進行細(xì)分，通常會把液體活檢領(lǐng)域劃分為3個主要方面：循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）、循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）、細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）。

ctDNA來自于壞死腫瘤細(xì)胞、凋亡腫瘤細(xì)胞、循環(huán)腫瘤、腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體[9]。ctDNA帶有腫瘤原發(fā)灶或轉(zhuǎn)移灶的生物信息（包括突變、重排、甲基化等），血液中的ctDNA數(shù)量和性質(zhì)受到多種因素影響，腫瘤分期越高、負(fù)荷越大，ctDNA檢出率越高[10-11]。ctDNA片段大小為70～200 bp，通常大于非腫瘤性循環(huán)游離DNA，半衰期為16 min～2.5 h。ctDNA可用于監(jiān)測手術(shù)或化療后癌癥患者的腫瘤動態(tài)，這種個性化的基因檢測方法也普遍適用于其他類型的癌癥個體[12]。選擇靈敏度和特異性高周轉(zhuǎn)時間較短的液體活檢技術(shù)，能夠使臨床醫(yī)生及時獲得可能對患者進行前瞻性或者隨訪有用的信息[13]。

2 ctDNA的常見檢測平臺

隨著對ctDNA研究熱度的不斷攀升，各種高靈敏度和高特異性的檢測手段被開發(fā)出來，使檢測低豐度的ctDNA成為可能。目前常見的檢測手段有：磁珠乳液擴增法（beads emulsion，amplification and magnetics，BEAMing）、微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）、下一代測序（next-generation sequencing，NGS）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrixassisted laser desorption/ionization time of flight，MALDI-TOF）、擴增阻滯突變系統(tǒng)聚合酶鏈反應(yīng)（amplification refractory mutation system polymerase chain reaction，ARMS-PCR）等。見表1。

BEAMing是第1種通過臨床驗證的液體聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）活檢技術(shù)，其檢測結(jié)直腸癌患者中RAS突變狀態(tài)的能力已通過CE認(rèn)證。BEAMing是將單個獨立的DNA分子同油包水乳液中的磁珠相連接，隨后進行PCR擴增，然后通過與特定的突變型或野生型熒光等位基因特異性探針雜交來確定與磁珠結(jié)合的DNA的突變狀態(tài)，最后采用流式細(xì)胞術(shù)來檢測存在于血漿中的突變體DNA的水平[8，14]。

ddPCR是將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬個納米級的微滴，經(jīng)PCR擴增后，逐個對每個微滴進行檢測，根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度[15]。

NGS是采用邊合成邊測序的策略將數(shù)百萬DNA模板同時進行測序，基于大規(guī)模平行測序技術(shù)，大幅提高了效率，并使成本顯著下降[16]。NGS是目前基因研究的主要方法之一，運用NGS進行基因組DNA序列分析和風(fēng)險預(yù)測，在腫瘤研究領(lǐng)域作出了極大貢獻[17]。

質(zhì)譜是一種高特異性和準(zhǔn)確性的分析技術(shù)，可用于確定原子和分子的質(zhì)量、分析分子的元素組成、闡明分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)[18]、通過測定離子飛行時間得到離子的質(zhì)荷比、檢測離子。MALDI-TOF近年來被廣泛應(yīng)用于核酸分子診斷領(lǐng)域，如唐氏綜合征篩查、病原體分型檢測、腫瘤藥物基因突變檢測等[19-20]。

ARMS-PCR的基本原理是由于TaqDNA聚合酶缺少3'→5'外切酶活性，在一定條件下PCR引物3'末端的錯配導(dǎo)致產(chǎn)物的急劇減少，針對不同的已知突變，設(shè)計適當(dāng)?shù)囊铮ㄟ^PCR直接達(dá)到區(qū)分突變型和野生型基因的目的[21]。

表1 ctDNA檢測方法比對

3 ctDNA在結(jié)直腸癌診療中的應(yīng)用

3.1 ctDNA對結(jié)直腸癌患者預(yù)后評估價值

當(dāng)前監(jiān)測結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)的方法包括對血液中癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）的檢測，以及周期性電子計算機斷層掃描檢查。但是由于前者的低靈敏度、后者的輻射以及成本限制等，術(shù)后結(jié)直腸癌患者病灶狀況未能得到很好的監(jiān)測[22]。

ctDNA是轉(zhuǎn)移性結(jié)腸直腸癌患者治療過程中頗具前景的生物標(biāo)志物。有研究結(jié)果顯示，手術(shù)前所有受試者均可檢測到ctDNA，血液檢測結(jié)果顯示ctDNA水平的變化與手術(shù)切除范圍相關(guān)。手術(shù)后檢測出ctDNA的受試者一般在1年內(nèi)復(fù)發(fā)。ctDNA可能是一個比目前的標(biāo)準(zhǔn)生物標(biāo)志物CEA更可靠和敏感的指標(biāo)[12]，可以提供早期干預(yù)的治療窗口[23]。

2項背靠背發(fā)表的基于ctDNA檢測微小殘留病變（minimal residual disease，MRD）的文獻指出，評估Ⅰ～Ⅲ期結(jié)直腸癌患者根治性術(shù)后ctDNA的突變情況，能有效預(yù)測患者復(fù)發(fā)風(fēng)險[11，24]。2項研究都在術(shù)后采取了多點取樣監(jiān)測的方式，并比較了不同的監(jiān)測模式對預(yù)測復(fù)發(fā)風(fēng)險的準(zhǔn)確性，發(fā)現(xiàn)術(shù)后單點、輔助治療后單點和綜合多點隨訪監(jiān)測這3種模式下，ctDNA陽性患者復(fù)發(fā)風(fēng)險分別是ctDNA陰性患者的7倍、14倍和40倍，說明多點的ctDNA MRD監(jiān)測是最有效預(yù)測復(fù)發(fā)風(fēng)險的方式，準(zhǔn)確性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于術(shù)后單點監(jiān)測。這是首次有循證醫(yī)學(xué)證據(jù)充分證實這個論點，對于后續(xù)規(guī)范化MRD的臨床應(yīng)用有重要意義。

3.2 ctDNA在結(jié)直腸癌個體用藥中的應(yīng)用

結(jié)直腸癌細(xì)胞主要通過2種策略逃避表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）阻斷。第1種耐藥機制在43%的患者樣本和58.8%的細(xì)胞樣本中可被檢測到[25]。近來更多的證據(jù)顯示，KRAS第2號外顯子以外的突變以及NRAS突變也可以預(yù)測患者對西妥昔單抗和帕尼單抗（作用于EGFR的單克隆抗體）的耐藥。KRAS基因野生型患者可從抗EGFR單藥治療或聯(lián)合化療中獲益，但KRAS基因第2號外顯子的第12或13位密碼子發(fā)生突變者不能受益[26]。因此，專家組強烈建議對所有轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌患者進行腫瘤組織（原發(fā)瘤或轉(zhuǎn)移灶均可）的KRAS/NRAS基因突變檢測。已知KRAS/NRAS突變的患者，均不應(yīng)接受西妥昔單抗或帕尼單抗治療，無論單藥還是與化療聯(lián)合，因為這些患者不但沒有機會從治療中獲益，而且還將面臨治療的毒性和費用[27-28]。一項Ⅲ期臨床研究對化療+貝伐珠單抗及化療+貝伐珠單抗+西妥昔單抗在轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌中一線治療的療效進行對比，發(fā)現(xiàn)BRAF突變型的患者在這2種治療中療效都不好，中位無進展生存時間（progression-free survival，PFS）及總生存期（overall survival，OS）都遠(yuǎn)低于野生型患者[29]。

第2種耐藥機制涉及EGFR細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域突變，在10.8%的患者樣本和29%的細(xì)胞中可被檢測到[25]。EGFR基因胞外域也發(fā)現(xiàn)了與耐藥相關(guān)的基因突變。V441D和V441GEGFR突變體與野生型EGFR相比，西妥昔單抗和帕尼單抗的結(jié)合力顯著降低[30]；G465R或G465EEGFR序列突變對受體細(xì)胞外部的結(jié)構(gòu)域Ⅲ產(chǎn)生影響且結(jié)構(gòu)分析表明，這些突變可能影響西妥昔單抗的結(jié)合[31]；S492REGFR細(xì)胞外域突變將干擾西妥昔單抗的結(jié)合并且產(chǎn)生抗藥性[32]。

綜上所述，結(jié)直腸癌患者ctDNA的檢測和監(jiān)測對患者預(yù)后管理、治療選擇和療效評估至關(guān)重要。ctDNA中檢測到的突變狀況對制定治療方案具有啟示意義，將ctDNA作為生物標(biāo)志物是非常有前景的，會使臨床和患者受益。因此，需要盡快建立標(biāo)準(zhǔn)化的、可被醫(yī)生和患者接受的檢測方式和結(jié)果解讀指南。