Xpert MTB/RIF技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥性快速檢測中的價(jià)值

劉 軍，劉 濤，戴碗琴，王藝翔，侯彥強(qiáng)

（上海市松江區(qū)中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201600）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）引起的傳染性疾病，是人類第九大死因，死亡率在傳染性疾病中排名第一[1]，目前沒有任何疫苗能有效預(yù)防成人結(jié)核病。我國是全球30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，每年新發(fā)結(jié)核病病例約90萬例，居全球第3位[2]。我國結(jié)核病防治的主要挑戰(zhàn)是耐多藥結(jié)核病發(fā)現(xiàn)率低、病原學(xué)確診率低、篩查率低、耐藥率高。傳統(tǒng)的涂片和培養(yǎng)方法檢出率低、培養(yǎng)周期長。Xpert MTB/RIF技術(shù)可在2 h內(nèi)檢測MTB及其對利福平的耐藥性[3]。本研究采用Xpert MTB/RIF技術(shù)對痰液樣本進(jìn)行MTB及利福平耐藥性的檢測，評價(jià)Xpert MTB/RIF技術(shù)在耐多藥結(jié)核病快速診斷中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集2017年12月—2019年5月上海市松江區(qū)中心醫(yī)院1 573例初診疑似肺結(jié)核患者痰液樣本，剔除液體培養(yǎng)污染11例，剩余1 562例用于統(tǒng)計(jì)分析?；颊吣? 112例（71%），年齡（43±18）歲；女450例（29%），年齡（41±16）歲。根據(jù)WS 288—2017《肺結(jié)核診斷》[4]，肺結(jié)核的診斷以病原學(xué)（包括細(xì)菌學(xué)、分子生物學(xué)）檢查為主，結(jié)合流行病史、臨床表現(xiàn)、胸部影像、輔助檢查及鑒別診斷結(jié)果，綜合分析后做出臨床診斷，以病原學(xué)和病理學(xué)檢查結(jié)果為確診依據(jù)。

1.2 儀器與試劑

Xpert MTB/RIF GeneXpert系統(tǒng)（美國Cepheid公司），BACTEC MGIT 960系統(tǒng)及配套培養(yǎng)基、添加劑、消化液（美國BD公司），抗酸染液（珠海BASO公司）。

1.3 方法

1.3.1 涂片抗酸染色法 留取初診疑似肺結(jié)核患者即時(shí)痰、夜間痰和次日晨痰各1份，按《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[5]進(jìn)行直接涂片抗酸染色鏡檢。

1.3.2 液體培養(yǎng)法 取2 mL痰液經(jīng)N-乙酰-L-半胱氨酸-氫氧化鈉消化處理，強(qiáng)力旋渦震蕩后室溫靜置，加入磷酸鹽緩沖液，3 000×g離心15 min，棄上清液，沉淀后制備成懸濁液，取0.5 mL接種于培養(yǎng)管，采用BACTEC MGIT 960系統(tǒng)進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.3 Xpert MTB/RIF法 取1 mL黏稠或膿性痰液加入前處理管中，加入2倍處理液，旋緊螺旋蓋，強(qiáng)力旋渦震蕩后室溫靜置，充分液化后用專用無菌吸管吸取0.5 mL，緩慢加入Cartridge單獨(dú)反應(yīng)盒內(nèi)，采用Xpert MTB/RIF GeneXpert系統(tǒng)自動(dòng)檢測，約2 h即可直接讀取MTB和利福平耐藥性結(jié)果，具體操作參照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊》[6]。

1.3.4 菌群鑒定和藥物敏感性確認(rèn) 將液體培養(yǎng)陽性樣本送上海市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行分枝桿菌鑒定（PNB法、TCH法和28 ℃培養(yǎng)）和一線抗結(jié)核藥物（利福平、異煙肼、鏈霉素、乙胺丁醇）敏感性試驗(yàn)（傳統(tǒng)比例法）。

1.3.5 結(jié)果判讀 直接涂片抗酸染色法結(jié)果根據(jù)抗酸染色量的多少判為4+、3+、2+、1+、條數(shù)和陰性；液體培養(yǎng)法根據(jù)BACTEC MGIT 960系統(tǒng)報(bào)陽情況，經(jīng)抗酸染色鏡檢排除雜菌的污染后，再送上海市疾病預(yù)防控制中心進(jìn)行菌群鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)；Xpert MTB/RIF法的結(jié)果以高、中、低、極低和未檢出5個(gè)量級來表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例或率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種方法MTB檢測效能比較

2.1.1 3種方法檢測MTB的敏感性 Xpert MTB/RIF法、液體培養(yǎng)法和直接涂片抗酸染色法檢測MTB的敏感性分別為22.6%（353/1 562）、25.48%（398/1 562）和13.06%（204/1 562）。

2.1.2 3種方法MTB檢測結(jié)果一致性 Xpert MTB/RIF法與液體培養(yǎng)法的符合率為93.92%（1 467/1 562），差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.55，P＞0.05）；Xpert MTB/RIF法與直接涂片抗酸染色法的符合率為89.44%（1 397/1 562），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=48.51，P＜0.001）。見表1。

表1 3種方法MTB檢測結(jié)果一致性 例

2.1.3 Xpert MTB/RIF法與液體培養(yǎng)法MTB檢測結(jié)果比較 1 562例初診疑似肺結(jié)核患者中，以液體培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF法檢測204例直接涂片抗酸染色法陽性樣本MTB的敏感性和特異性分別為98.96%（190/192）和50.00%（6/12），與液體培養(yǎng)法比較檢測結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.841，P＞0.05）；Xpert MTB/RIF法檢測1 358例直接涂片抗酸染色法陰性樣本MTB的敏感性和特異性分別為66.99%（138/206）和98.35%（1 133/1 152），與液體培養(yǎng)法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.635，P＜0.05）；Xpert MTB/RIF法檢測1 562例初診疑似肺結(jié)核患者痰液樣本MTB的敏感性為82.41%（328/398），特異性為97.85%（1 139/1 164），與液體培養(yǎng)法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.55，P＞0.05）。見表2。

表2 Xpert MTB/RIF法與液體培養(yǎng)法MTB檢測結(jié)果 例

2.2 Xpert MTB/RIF法MTB檢測效能分析

經(jīng)上海市疾病預(yù)防控制中心菌群鑒定確認(rèn)，188例液體培養(yǎng)陽性樣本中，171例檢出結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTC）、17例檢出非結(jié)核分枝桿菌（non-tuberculousMycobacterium，NTM）。Xpert MTB/RIF法的檢測敏感性為91.23%（156/171）、特異性為88.24%（15/17）、準(zhǔn)確性為90.96%（171/188）。Xpert MTB/RIF法與上海市疾病預(yù)防控制中心菌群鑒定結(jié)果的比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.109，P＞0.05）。

2.3 Xpert MTB/RIF法檢測利福平耐藥性結(jié)果

經(jīng)上海市疾病預(yù)防控制中心藥物敏感性試驗(yàn)確認(rèn)，171株MTC中，利福平敏感154株、耐藥17株，耐藥率為9.94%；Xpert MTB/RIF法檢測利福平敏感156株、耐藥15株，耐藥率為8.77%。Xpert MTB/RIF法檢測利福平耐藥的敏感性為82.35%（14/17）、特異性為99.35%（1/154）。Xpert MTB/RIF法與傳統(tǒng)比例法藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.138，P＞0.05）。

3 討論

目前，我國結(jié)核病診斷相關(guān)檢測方法中，傳統(tǒng)的直接涂片抗酸染色法陽性檢出率低，生物安全要求高，不能及時(shí)發(fā)現(xiàn)患者；液體培養(yǎng)法通過添加生長刺激劑，雖然提高了檢測敏感性、縮短了報(bào)陽時(shí)間，但仍需要2～6周的培養(yǎng)時(shí)間，無法滿足臨床診療的需求。隨著分子診斷技術(shù)的發(fā)展，Xpert MTB/RIF檢測技術(shù)具有較高的敏感性和特異性，在單獨(dú)的反應(yīng)盒內(nèi)檢測，操作簡單，生物危害度小，2 h內(nèi)就可以檢測MTB及其對利福平的耐藥性[7]，對于臨床快速診斷和及時(shí)治療疾病具有重要意義。

本研究采用Xpert MTB/RIF法、液體培養(yǎng)和直接涂片抗酸染色法檢測1 562例初診疑似肺結(jié)核患者痰液樣本中的MTB，敏感性分別為22.6%、25.48%和13.06%，與張青等[8]的研究結(jié)論一致，但與劉慧梅等[9]的研究結(jié)果比較，3種方法陽性檢出率均較低，可能與選擇的檢測對象不同有關(guān)，本研究選取初診疑似肺結(jié)核患者為研究對象，而劉慧梅等的研究對象是經(jīng)過臨床診斷的結(jié)核病患者。本研究Xpert MTB/RIF法與液體培養(yǎng)法檢測結(jié)果有較高的一致性（χ2=3.55，P＞0.05），敏感性顯著高于直接涂片抗酸染色法（χ2=48.51，P＜0.001），與徐東芳等[10]的研究結(jié)論一致。本研究以液體培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，在204例直接涂片抗酸染色法陽性樣本中，Xpert MTB/RIF法檢測MTB的敏感性和特異性分別為98.96%和50.00%，與液體培養(yǎng)法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.841，P＞0.05），與劉亞芹等[11]的研究結(jié)論一致；Xpert MTB/RIF法檢測1 358例直接涂片抗酸染色陰性樣本MTB的敏感性和特異性分別為66.99%和98.35%，與液體培養(yǎng)法比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.635，P＜0.05），與劉亞芹等[11]的研究結(jié)論不一致，可能與液體培養(yǎng)陽性樣本中存在NTM有關(guān)。經(jīng)上海市疾病預(yù)防控制中心菌群鑒定確認(rèn)，本研究188例液體培養(yǎng)陽性樣本中，17例檢出NTM，Xpert MTB/RIF法只檢出2例，15例檢測結(jié)果為陰性，與譚英征等[12]的研究結(jié)論一致。與液體培養(yǎng)法比較，Xpert MTB/RIF法檢測MTB的敏感性為82.41%，特異性為97.85%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=3.55，P＞0.05），與趙金云等[13]的研究結(jié)論一致。本研究結(jié)果表明，對于直接涂片抗酸染色法陽性和陰性樣本，Xpert MTB/RIF法均有著較高的敏感性和特異性。

本研究以上海市疾病預(yù)防控制中心菌群鑒定結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF法鑒定菌群的敏感性為91.23%、特異性為88.24%、準(zhǔn)確性為90.96%，與液體培養(yǎng)法檢測結(jié)果比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.109，P＞0.05），有較高的一致性，與杜安玲[14]的研究結(jié)論一致。

本研究以傳統(tǒng)比例法藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，Xpert MTB/RIF法檢測利福平耐藥性的敏感性為82.35%、特異性為99.35%，Xpert MTB/RIF法與傳統(tǒng)比例法比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.138，P＞0.05），有較高的一致性，與張玉華等[15]和宋世森[16]的研究結(jié)論一致。其中2例檢測結(jié)果不一致，可能與MTB利福平耐藥決定區(qū)域特定rpoB基因突變有關(guān)。

結(jié)核病的控制與早期篩查發(fā)現(xiàn)、合理規(guī)范治療密切相關(guān)，直接涂片抗酸染色法敏感性低、液體培養(yǎng)法耗時(shí)長，均難以做到早期發(fā)現(xiàn)、快速診斷。XpertMTB/RIF技術(shù)作為世界衛(wèi)生組織認(rèn)可的一種快速而靈敏的診斷結(jié)核病的方法，具有較高的檢測敏感性和特異性，操作簡單，生物危害性低，2 h即可檢測MTB，并篩查利福平耐藥性，對臨床快速診斷和合理、規(guī)范治療具有重要意義。 雖然儀器設(shè)備和檢測成本較高，對于耐藥性的篩查也僅限于利福平，不能同時(shí)篩查MTB對異煙肼等抗結(jié)核藥物的耐藥性，但與直接涂片法和液體培養(yǎng)法比較，在快速診斷和篩查方面邁出了一大步，且操作簡便，硬件設(shè)施要求低，適合在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)結(jié)核病檢測實(shí)驗(yàn)室大力推廣。