循環(huán)KRAS突變檢測(cè)在結(jié)直腸癌患者新輔助治療療效中的臨床價(jià)值探討

房永贇，盧大儒，沈立松

（復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438）

目前，臨床對(duì)結(jié)直腸癌的治療難點(diǎn)之一是局部晚期結(jié)直腸癌。為了提高局部晚期結(jié)直腸癌的手術(shù)根治性切除率，并有效降低術(shù)后局部復(fù)發(fā)率，術(shù)前進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的同步放化療，即新輔助治療，已經(jīng)成為這類患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方式。新輔助治療后的評(píng)效對(duì)于預(yù)測(cè)手術(shù)的根治性切除率和制定有效的術(shù)后輔助治療策略都至關(guān)重要。目前常用的評(píng)效方法是基于影像學(xué)或術(shù)后組織學(xué)分級(jí)來(lái)開(kāi)展的。外周血循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）近年已成為腫瘤分子診斷新的研究熱點(diǎn)，其能夠更靈敏地、更特異地反應(yīng)腫瘤細(xì)胞的體內(nèi)負(fù)荷，從而提示不同治療方式對(duì)腫瘤的治療效果。原癌基因（V-Ki-ras2 Kirsten ratsarcoma viral oncogene homolog，KRAS）在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中起重要調(diào)控作用，正常KRAS可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，但KRAS突變會(huì)持續(xù)刺激腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，打亂生長(zhǎng)規(guī)律，從而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。本研究初步探討ctDNAKRAS突變豐度變化在評(píng)價(jià)新輔助治療療效方面的潛在應(yīng)用價(jià)值。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象

選取河南省腫瘤醫(yī)院2016年3月—2018年6月住院的結(jié)直腸癌患者。入組標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理學(xué)診斷及影像學(xué)檢查證實(shí)為結(jié)直腸腺癌；（2）經(jīng)盆腔磁共振成像平掃加增強(qiáng)和/或直腸腔內(nèi)B超提示，腫瘤浸潤(rùn)深度為T3～T4期和/或有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；（3）經(jīng)全面檢查發(fā)現(xiàn)原初轉(zhuǎn)移；（4）患者年齡≥18歲且≤70歲；（5）前期尚未接受任何抗腫瘤治療，未發(fā)現(xiàn)明顯放、化療及手術(shù)禁忌癥，能夠且愿意接受新輔助治療；（6）簽署了知情同意書(shū)，并能夠提供新輔助治療前、后外周血。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）腫瘤組織經(jīng)分子診斷為KRAS野生型；（2）新輔助治療前外周血ctDNA中未檢測(cè)出KRAS突變；（3）因各種原因中斷了新輔助治療及后續(xù)手術(shù)（如患者無(wú)法耐受新輔助治療或新輔助治療過(guò)程中出現(xiàn)疾病進(jìn)展無(wú)法手術(shù)等），無(wú)法獲得影像學(xué)或病理學(xué)評(píng)估數(shù)據(jù)。

1.2 方法

采用ddPCR KRAS Screening Multiplex Kit（美國(guó)Bio-Rad公司）檢測(cè)KRAS突變，其可以有效地檢測(cè)7種最常見(jiàn)的KRAS突變（包括G12A、G12C、G12D、G12V、G12R、G12S、G13D）和野生型KRAS；采用MagicPure cell-free DNA Kit（北京TransGen Biotech公司）抽提ctNDA，取10 ng ctDNA后，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求配制成聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chian reaction，PCR）反應(yīng)體系，隨后加到微滴發(fā)生卡（美國(guó)Bio-Rad公司）中的樣品孔內(nèi)，并在底層的油滴孔中各加入70 μL的微滴生成油，然后在QX200 Droplet Generator（美國(guó)Bio-Rad公司）中制備成微滴，并在QX20數(shù)字PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）上進(jìn)行擴(kuò)增。PCR結(jié)束后將孔板放入QX200 Droplet Reader（美國(guó)Bio-Rad公司）中檢測(cè)熒光信號(hào)，并利用Quanta Soft（美國(guó)Bio-Rad公司）判讀并計(jì)算KRAS突變序列在整個(gè)PCR反應(yīng)體系中的突變頻率（mutant-allele frequency，MAF）。

分別采集入組患者在接受新輔助治療前1天及完成新輔助治療后1周清晨空腹靜脈血10 mL于促凝管中，1 509×g離心10 min后分離血清待檢，癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA與糖類抗原19-9（carbohydrate antigen 19-9，CA19-9）采用Cobas 6000全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光儀及其配套試劑（瑞士Roche公司）進(jìn)行檢測(cè)，當(dāng)日質(zhì)控，以保證結(jié)果的有效性。參考區(qū)間：CEA＜5 ng/mL，CA19-9＜37 U/mL。

1.3 療效評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

基于胸、腹、盆腔電子計(jì)算機(jī)斷層掃描（computed tomography，CT）開(kāi)展新輔助治療的療效評(píng)價(jià)，參考羅亞紅等[1]的RECIST標(biāo)準(zhǔn)針對(duì)直徑≥20 mm的病灶在新輔助治療前、后影像學(xué)的變化進(jìn)行分類：（1）完全響應(yīng)（complete response，CR），即已知腫瘤病灶完全消失；（2）部分響應(yīng)（partial response，PR），即目標(biāo)病灶最長(zhǎng)徑之和減少＞30%；（3）疾病進(jìn)展（progressed disease，PD），即目標(biāo)病灶最長(zhǎng)徑之和增加＞20%；（4）疾病穩(wěn)定（stable disease，SD），即變化介于PD和PR之間。

將入組患者新輔助治療后接受手術(shù)切除的腫瘤組織樣本按照每厘米取材1次切片，交由至少2位病理學(xué)專家獨(dú)立評(píng)分。分級(jí)主要依據(jù)鏡下殘留腫瘤細(xì)胞和纖維化的比例，參照美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）第7版的腫瘤分級(jí)（tumor regression grading，TRG）評(píng)分系統(tǒng)[2]，分為4級(jí)：（1）完全退縮（TRG0），即鏡下未見(jiàn)腫瘤細(xì)胞；（2）中等退縮（TRG1），即鏡下僅見(jiàn)單個(gè)或小灶腫瘤細(xì)胞；（3）輕微退縮（TRG2），即有腫瘤殘留但少于纖維化間質(zhì)；（4）無(wú)退縮（TRG3），即無(wú)或有少量腫瘤細(xì)胞壞死，存在廣泛的殘留腫瘤。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料采用x±s表示，組間比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入組患者的疾病特征及新輔助治療療效評(píng)價(jià)結(jié)果

入組患者中T3和T4期的患者分別為25例和28例；根據(jù)影像學(xué)評(píng)估，有2例（4%）患者為CR，40例（75%）患者為PR，9例（17%）患者為SD，2例（4%）患者為PD。術(shù)后腫瘤組織病理學(xué)評(píng)效診斷中TRG0、TRG1、TRG2和TRG3的患者分別為2例（4%）、38例（72%）、7例（13%）和6例（11%）。影像學(xué)評(píng)效為CR、PR或PD的患者，均在術(shù)后腫瘤組織病理學(xué)評(píng)效診斷中相應(yīng)地被評(píng)為TRG0、TRG1或TRG3。見(jiàn)表1。

2.2 入組患者的外周血ctDNA KRAS突變?cè)谛螺o助治療前、后的變化

入組患者組織檢測(cè)為KRAS突變，新輔助治療前外周血微滴式數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）檢測(cè)ctDNAKRAS突變，檢出率為100%。ddPCR檢出的外周血ctDNAKRAS的MAF在患者接受新輔助治療前、后發(fā)生變化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 MAF差值（治療前MAF-治療后MAF）與影像學(xué)評(píng)效比較

表1 入組患者的基本特征

以MAF差值為因變量，采用最小顯著性差異法（least-significant difference，LSD）做MAF差值與影像學(xué)評(píng)效的比較分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

2.4 MAF差值與病理學(xué)評(píng)效多重比較

以MAF差值為因變量，采用LSD做MAF差值與病理學(xué)評(píng)效的比較分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

2.5 患者血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果評(píng)效

用患者CEA和CA19-9變化差值（均為新輔助治療前-治療后）分別與影像學(xué)和病理學(xué)評(píng)效作比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 外周血ctDNA KRAS突變?cè)谛螺o助治療前、后的變化

表3 MAF差值與影像學(xué)評(píng)效多重比較

表4 MAF差值與病理學(xué)評(píng)效多重比較

3 討論

對(duì)于局部晚期結(jié)直腸癌患者而言，新輔助治療的優(yōu)點(diǎn)為：（1）在腫瘤各級(jí)血管未損傷前予以化療，可提高局部化療藥物的濃度；（2）可有效治療臨床或亞臨床的微小轉(zhuǎn)移灶，減少術(shù)后的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移；（3）降低臨床分期，縮小原發(fā)病灶，增加手術(shù)機(jī)會(huì)；（4）確定腫瘤對(duì)化療藥物的敏感性，以指導(dǎo)制定術(shù)后治療計(jì)劃。但新輔助治療也可能因?yàn)槟[瘤的早期進(jìn)展，使患者錯(cuò)過(guò)了手術(shù)的窗口期。可見(jiàn)針對(duì)新輔助治療的療效進(jìn)行及時(shí)而準(zhǔn)確的評(píng)估，才能夠充分發(fā)揮新輔助治療的優(yōu)點(diǎn)，正確指導(dǎo)后期的治療[3]。

新輔助治療的評(píng)效有多種方法，血清學(xué)指標(biāo)（CEA和CA19-9）被認(rèn)為是可用于判斷病情發(fā)展的重要指標(biāo)之一[4]。在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)CEA和CA19-9的水平對(duì)于新輔助治療較為敏感，疾病得到有效控制的患者（影像學(xué)評(píng)效出現(xiàn)CR、PR、SD或病理學(xué)評(píng)效出現(xiàn)TRG0、TRG1、TRG2的患者），血清學(xué)指標(biāo)大都發(fā)生了較顯著的變化。這充分說(shuō)明了血清學(xué)指標(biāo)在評(píng)價(jià)治療效果上具有一定的價(jià)值[5]。但是我們還發(fā)現(xiàn)，血清學(xué)指標(biāo)的變化并不能清晰地對(duì)應(yīng)于不同程度的治療效果，如1例患者影像學(xué)評(píng)效為PR，病理學(xué)評(píng)效為TRG1，而CEA指標(biāo)卻上升了44.4%。血清學(xué)標(biāo)志物的的另一個(gè)不足之處在于，有相當(dāng)一部分患者血清標(biāo)志物為陰性，無(wú)法用于監(jiān)測(cè)。

影像學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和普及使影像學(xué)評(píng)效成為最常見(jiàn)的用于指導(dǎo)新輔助治療療效評(píng)估的方法[6]。RECIST標(biāo)準(zhǔn)明確了病灶測(cè)量方法，并能夠有效地綜合評(píng)估多個(gè)病灶對(duì)于治療的響應(yīng)。本研究中的53例患者中，有42例患者影像學(xué)評(píng)效為CR和PR，其中41例（98%，41/42）在新輔助治療后外周血ctDNAKRASMAF相比新輔助治療有所下降，這4例患者中有2例為CR，39例為PR；僅1例（2%，1/42）出現(xiàn)新輔助治療后外周血ctDNAKRASMAF輕微上升（由2.38%上升到2.41%），該患者的影像學(xué)評(píng)效為PR。53例患者中，有11例影像學(xué)評(píng)效為SD和PD，其中5例（45%，5/11）在新輔助治療后外周血ctDNAKRASMAF相比新輔助治療前下降，影像學(xué)評(píng)效均為SD，另外6例（55%，6/11）新輔助治療后外周血ctDNAKRASMAF上升，其中4例SD、2例PD，說(shuō)明影像學(xué)評(píng)效并不能顯著區(qū)分SD和PD的情況。

病理學(xué)評(píng)效作為一種最直觀、最準(zhǔn)確的腫瘤治療反應(yīng)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)預(yù)后有重要參考價(jià)值，但其缺點(diǎn)是存在滯后性及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)存在主觀因素[7]。本研究的53例患者中，腫瘤顯著退縮為40例（包含2例TRG0和38例TRG1的患者），其中39例（98%，39/40）在新輔助治療后外周血ctDNAKRASMAF相比治療前有所下降，僅1例（2%，1/40）患者出現(xiàn)新輔助治療后外周血ctDNAKRASMAF輕微上升（由2.38%上升到2.41%），該患者的退縮評(píng)級(jí)為TRG1，對(duì)于這例患者，需要后期進(jìn)一步隨訪其復(fù)發(fā)情況后進(jìn)行綜合解釋。腫瘤未顯著退縮（包含TRG2和TRG3）的13例患者中，有7例（54%，7/13）在新輔助治療后外周血ctDNAKRASMAF低于治療前，其中4例為TRG2、3例為TRG3；另外6例（46%，6/13）患者治療后外周血ctDNAKRASMAF升高，其中3例TRG2、3例TRG3。

影像學(xué)評(píng)效與金標(biāo)準(zhǔn)的病理組織學(xué)評(píng)效總體上高度一致[1，8]。其CR、PR和PD分別有效地對(duì)應(yīng)于組織病理學(xué)評(píng)效的TRG0、TRG1、TRG3。最大的差別主要來(lái)自于影像學(xué)評(píng)效提示SD的患者，組織病理學(xué)評(píng)效可能包含了TRG1、TRG2、TRG3的可能。這種不一致充分說(shuō)明了腫瘤大小變化不能完全反映新輔助治療后腫瘤生物學(xué)性質(zhì)變化，解剖學(xué)改變比功能改變要慢。而由于ctDNA來(lái)自凋亡腫瘤細(xì)胞的DNA碎片，且半衰期較短，因此相比影像學(xué)更能夠?qū)崟r(shí)反映腫瘤的功能學(xué)變化。

綜上所述，影像學(xué)評(píng)效為SD的患者外周血ctDNAKRAS突變的變化趨勢(shì)與組織病理學(xué)評(píng)效得到的治療效果一致，能有效彌補(bǔ)影像學(xué)評(píng)效的不足之處，也能反映出腫瘤對(duì)于新輔助治療的響應(yīng)和腫瘤負(fù)荷的變化，區(qū)分SD和PD。因此，在新輔助治療階段監(jiān)測(cè)外周血ctDNAKRAS突變，能夠有效地評(píng)估腫瘤的治療效果。外周血ctDNAKRAS突變作為一種新的分子評(píng)效手段能有效補(bǔ)充傳統(tǒng)的治療評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，協(xié)助臨床制定更精準(zhǔn)的治療策略[9]。由于本研究的病例較少，且選擇的是外周血ctDNAKRAS突變患者，后續(xù)研究應(yīng)該采用更廣泛的突變檢測(cè)手段，明確外周血ctDNAKRAS突變?cè)谛螺o助治療療效中的臨床應(yīng)用價(jià)值。