北京市某院難辨梭菌臨床分離株耐藥性及毒素基因攜帶情況分析

邵冬華，宋 燕，梁國(guó)威

（航天中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100049）

難辨梭菌感染目前已經(jīng)成為院內(nèi)感染的主要威脅之一，在一些特定區(qū)域甚至超過耐甲氧西林金黃色葡萄球菌而成為院感防控最棘手的問題[1]。難辨梭菌的致病性與其產(chǎn)生的2種致病毒素有關(guān)。A毒素（Clostridium difficiletoxin A，TcdA）為腸毒素，能趨化中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)回腸壁釋放細(xì)胞因子，導(dǎo)致液體大量分泌和腸壁出血壞死；B毒素（Clostridium difficiletoxin B，TcdB）為細(xì)胞毒素，能使肌動(dòng)蛋白解聚，損壞細(xì)胞骨架，致細(xì)胞團(tuán)縮壞死，能直接損傷腸壁細(xì)胞。臨床致病菌株以攜帶A、B 2種毒素基因（即A+B+菌株）多見，A毒素也一直被認(rèn)為是難辨梭菌引起腹瀉的主要致病因素。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，臨床分離的部分菌株編碼A毒素的基因tcdA常出現(xiàn)110 bp的缺失，這種攜帶缺失的tcdA基因的菌株，即A-B+菌株，在歐洲及亞洲的一些國(guó)家相繼出現(xiàn)，同樣可以引起腹瀉，甚至引發(fā)偽膜性腸炎[2]。航天中心醫(yī)院相關(guān)性腹瀉（Clostridium difficile-associated diarrhea，CDAD）的既往治療用藥物主要為甲硝唑和萬(wàn)古霉素。但近年來難辨梭菌對(duì)甲硝唑和萬(wàn)古霉素的敏感性呈逐年降低的趨勢(shì)，因此監(jiān)測(cè)難辨梭菌對(duì)常用抗菌藥物的敏感性非常重要。本研究對(duì)航天中心醫(yī)院難辨梭菌的耐藥性及致病菌株攜帶A、B毒素情況進(jìn)行初步分析，以期為臨床治療提供參考。

1 材料和方法

1.1 樣本來源

收集2015年3月—2016年5月航天中心醫(yī)院住院期間出現(xiàn)不明原因腹瀉患者的糞便樣本335例。

1.2 主要試劑和儀器

MASTER MIX [天根生化科技（北京）有限公司]，ABI 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司），厭氧菌培養(yǎng)系統(tǒng)（荷蘭ANOXOMAT公司），質(zhì)譜儀及難辨梭菌鑒定培養(yǎng)基（chromIDClostridium difficileagar，CDIF）（法國(guó)生物梅里埃公司），厭氧血平板（天津金章公司），阿莫西林、甲硝唑、克林霉素、萬(wàn)古霉素、莫西沙星、氨芐西林-舒巴坦、美羅培南藥物敏感性試驗(yàn)紙條（鄭州安圖公司），難辨梭菌標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC 9689）由中日友好醫(yī)院贈(zèng)送。

1.3 方法

1.3.1 樣本處理 取糞便樣本180～220 mg，置于2 mL離心管中。按試劑說明書要求加入500 μL SA緩沖液、100 μL SC緩沖液、15 μL Proteinase K，間歇振蕩1 min至樣本充分混勻。95 ℃孵育15 min，孵育過程中震蕩2～3次，渦旋震蕩15 s，再13 400×g離心3 min，分離上清液至新的離心管中，加入10 μL RNase A，震蕩混勻后室溫放置5 min。加入200 μL SH緩沖液，震蕩混勻，13 400×g離心3 min，收集上清液，置于0.5 mL Eppendorf管中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 糞便樣本tpi及A、B毒素基因檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[3]，采用TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）檢測(cè)難辨梭菌tpi基因及A、B毒素基因。反應(yīng)體系均為20 μL，其中細(xì)菌基因組DNA 1 μL，上、下游引物各1 μL，TaqMan-MGB探針1 μL。反應(yīng)條件：95 °C 2 min，95°C 15 s，57 °C 1 min，40個(gè)循環(huán)。引物序列見表1。

表1 難辨梭菌tpi、tcdA、tcdB、tcdAT引物及探針序列

1.3.3 難辨梭菌培養(yǎng)及鑒定 在難辨梭菌tpi基因陽(yáng)性的糞便樣本中加入等體積無水乙醇，充分混勻后室溫放置30 min。用接種環(huán)蘸取預(yù)處理過的糞便接種于CDIF，厭氧培養(yǎng)48 h，以培養(yǎng)基上呈現(xiàn)典型的灰色或黑色菌落為可疑菌落。采用質(zhì)譜儀進(jìn)一步驗(yàn)證可疑菌落，以確保鑒定結(jié)果準(zhǔn)確無誤。挑取確定為難辨梭菌的單個(gè)菌落接種于厭氧血平板進(jìn)行傳代，通過分離純化獲得更多的高純度難辨梭菌菌株。

1.3.4 體外藥物敏感性試驗(yàn) 根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2016年標(biāo)準(zhǔn)，采用E試驗(yàn)進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)。

1.3.5 患者一般情況比較 比較檢出A+B+菌株和A-B+菌株的患者的病史、臨床用藥史、實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果是否存在差異。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)經(jīng)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換為正態(tài)分布，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 糞便樣本tpi基因及A、B毒素基因檢測(cè)結(jié)果

335例糞便樣本中，56例檢出tpi基因（16.7%）。其中10例（17.9%）檢出A-B+菌株，46例（82.1%）檢出A+B+菌株。tpi基因陽(yáng)性菌株病區(qū)來源見圖1。

圖1 tpi基因陽(yáng)性菌株病區(qū)來源

2.2 細(xì)菌鑒定及體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

56株tpi基因陽(yáng)性菌株經(jīng)質(zhì)譜儀鑒定，均確定為難辨梭菌，其耐藥性見表2、表3。

2.3 A+B+菌株和A-B+菌株感染患者臨床特征比較

46例檢出A+B+菌株的患者年齡（76.1±14.3）歲，其中男27例（58.6%），年齡（75.7±15.4）歲；10例檢出A-B+菌株的患者中，男7例（70.0%），年齡（78.6±6.8）歲。檢出A+B+菌株和A-B+菌株男性患者所占比例及年齡比較無差異（P＞0.05）。檢出2種菌株的患者既往病史、臨床用藥史、常規(guī)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)比較無差異（P＞0.05），見表4～表6。

表2 56株tpi陽(yáng)性難辨梭菌對(duì)7種抗菌藥物的耐藥率

表3 多重耐藥菌株耐藥模式

表4 檢出2種菌株的患者既往病史比較 例（%）

表5 檢出2種菌株的患者臨床用藥史比較 例（%）

表6 檢出2種菌株患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)比較 ±s

表6 檢出2種菌株患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)指標(biāo)比較 ±s

注：*表示對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)值

淋巴細(xì)胞/中性粒細(xì)胞比值菌株 白細(xì)胞計(jì)數(shù)/（×109/L）中性粒細(xì)胞百分比/%淋巴細(xì)胞百分比/%C反應(yīng)蛋白/（mg/L）血肌酐/（mmol/L）白蛋白/（g/L）A+B+菌株 2.21±0.54* 73.35±11.72 17.65±9.08 3.05±0.70* 3.17±0.95* 4.05±0.44* 31.43±5.23 A-B+菌株 2.30±0.35* 74.03±12.11 17.56±12.1 2.94±0.92* 3.77±1.05* 4.28±1.06* 31.72±5.24 P值 0.615 0.868 0.980 0.648 0.101 0.269 0.875

3 討論

2017年，美國(guó)感染病協(xié)會(huì)和美國(guó)醫(yī)療保健流行病學(xué)學(xué)會(huì)推薦采用核酸擴(kuò)增方法診斷難辨梭菌感染[4]。本研究采用TaqMan-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)335例臨床不明原因腹瀉患者的糞便樣本進(jìn)行快速篩查。該方法直接提取糞便DNA檢測(cè)難辨梭菌菌屬tpi基因及毒素基因。由于tpi的編碼基因是難辨梭菌的管家基因，具有種的特異性，是難辨梭菌區(qū)別于其他細(xì)菌的特異性基因，可應(yīng)用于臨床樣本中難辨梭菌的快速篩選檢測(cè)[5]。本研究335例糞便樣本中有56例檢出難辨梭菌，其中10株（17.9%）A-B+菌，46株（82.1%）A+B+菌。A-B+菌株的分離率存在著地區(qū)差異，在歐洲及北美地區(qū)的分離率為0.2%～8.0%[6]，韓國(guó)和泰國(guó)的分離率曾達(dá)到40%[7-8]。A、B毒素在致病性方面也存在爭(zhēng)議，A毒素曾被認(rèn)為是引起腹瀉的主要原因，B毒素在艱難梭菌致病性方面起至關(guān)重要的作用，不同地區(qū)2種菌株所致疾病的嚴(yán)重程度和臨床特征也不盡相同。A-B+菌株既可以無癥狀定植，也可以引起偽膜性腸炎，A-B+菌株比A+B+菌株更易引起偽膜性腸炎[9]。本研究56例患者的年齡、性別、既往病史、臨床用藥史以及實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與KIM等[10]的研究結(jié)果一致。

近年來，難辨梭菌對(duì)甲硝唑和萬(wàn)古霉素的敏感性呈逐年降低趨勢(shì)，并出現(xiàn)了耐藥菌株。2011—2013年，美國(guó)難辨梭菌對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥率為13.2%[11]，巴西和以色列難辨梭菌對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥率分別為58.0%和31.5%[12-13]。本研究中，56株難辨梭菌對(duì)甲硝唑耐藥的有6株（10.7%），未發(fā)現(xiàn)對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥菌株，但有6株難辨梭菌表現(xiàn)出對(duì)萬(wàn)古霉素耐藥性下降的特征，其中2株對(duì)甲硝唑耐藥的同時(shí)，對(duì)萬(wàn)古霉素的敏感性下降，提示難辨梭菌對(duì)2種臨床首選抗菌藥物的耐藥性增高甚至耐藥。

本研究結(jié)果顯示，艱難梭菌對(duì)克林霉素的耐藥率達(dá)到75.0%，對(duì)莫西沙星的耐藥率為57.1%。克林霉素和莫西沙星雙重耐藥比例占耐藥菌株的51.8%，三重耐藥菌株占8.9%。難辨梭菌多重耐藥模式的出現(xiàn)也說明其耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)克林霉素的過量使用是A-B+菌株感染的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[10]。本研究56例患者均未使用過克林霉素，但對(duì)克林霉素的耐藥率卻達(dá)75.0%。在沒有藥物選擇性壓力存在的情況下，是什么原因?qū)е碌募?xì)菌耐藥需要進(jìn)一步研究。本研究56例感染難辨梭菌的患者年齡為（76.1±14.3）歲，其中約77%的患者來自于老年科、消化科及呼吸科，提示免疫功能下降、高齡、患有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病的患者易受難辨梭菌毒素攻擊。

綜上所述，航天中心醫(yī)院難辨梭菌臨床分離株耐藥形勢(shì)嚴(yán)峻，多重耐藥模式多見，A+B+菌株和A-B+菌株感染患者的臨床特征無差異。