堿性蛋白酶酶解血液蛋白的工藝優(yōu)化

蔡新東，馬石霞，冉權(quán)，馬咸瑩，王致遠(yuǎn)，張海霞，丁功濤*

（1.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124；2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心，甘肅 蘭州 730030）

我國是畜禽養(yǎng)殖大國，每年都有大量的畜禽被宰殺。據(jù)國家統(tǒng)計局?jǐn)?shù)據(jù)可知，2019年，我國的生豬的出欄量超過7億頭，占世界總產(chǎn)量近50%；各類家禽出欄量超過130億羽；牛出欄量超過5500萬頭，羊出欄量超過2億頭[1]。畜禽血液是畜禽屠宰加工的主要副產(chǎn)物，我國每年畜禽屠宰所產(chǎn)生的血液總量可超過80萬噸，血液含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素、微量元素、礦物質(zhì)等[2]。但是由于屠宰分散、技術(shù)落后、血液不易保存等原因，我國對畜禽血液的利用率還很低，每年屠宰的畜禽，只有1/4的血液進行合理利用[3]，而絕大多數(shù)作為廢棄物進行了排放，因而造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。

目前，我國利用畜禽血液生產(chǎn)生物制劑、蛋白飼料、添加劑、工業(yè)原料以及直接食用[4-5]。在生產(chǎn)生物制劑方面，主要用于生產(chǎn)一些血紅素鐵、血紅蛋白肽、血纖維蛋白原、凝血酶等醫(yī)療保健產(chǎn)品；在生產(chǎn)蛋白飼料方面，主要將畜禽血液作為原料，進行發(fā)酵，陳宇等采用復(fù)合菌株對豬血進行發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)品血腥味很淡，營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量達到了69%，還含有多種游離氨基酸和微量元素[6]。張濱等采用多菌種發(fā)酵血液產(chǎn)品，得到的產(chǎn)物中可溶性蛋白含量達到20%以上，并產(chǎn)生了濃郁的香氣[7]。

利用蛋白酶，可以將血液蛋白降解為利于動物消化吸收的多肽、小肽和氨基酸等。與游離氨基酸或全蛋白相比，動物對二肽和三肽形式的蛋白質(zhì)吸收效率更高，并且二肽和三肽形式的蛋白質(zhì)可能會改善飲食成分的吸收[8-9]。因此，將血液蛋白酶解并制成動物飼料，是解決廢棄血液的一個方向。本研究以無菌牛血為底物，用堿性蛋白酶酶解血液，通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)化酶解工藝參數(shù)，旨在為屠宰場處理廢棄血液提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

新鮮牦牛牛血（加入10%檸檬酸鈉抗凝，采于甘肅省臨夏州臨夏市枹罕鎮(zhèn)羅家堡村屠宰場），堿性蛋白酶（200000U/g，河南新仰韶生物科技有限公司），氫氧化鈉、鹽酸、鄰苯二甲酸氫鉀、硫酸、甲醛均為分析純，天津市百世化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 酶解溫度對牦牛血液蛋白水解度的影響

將牦牛血用蒸餾水稀釋成蛋白質(zhì)濃度為8%的溶血液[11]，在3%的酶濃度、pH為9.0、時間為5h、溫度分別為40℃、45℃、50℃、55℃、60℃的條件下進行酶解，然后測定酶解溶液的水解度[10]。

1.2.2 酶濃度對牦牛血液蛋白水解度的影響

將牦牛血用蒸餾水稀釋成蛋白質(zhì)濃度為8%的溶血液，在pH為9.0、時間為5h、溫度為55℃、酶濃度分別為1%、2%、3%、4%、5%的條件下進行酶解，然后測定酶解溶液的水解度[12]。

1.2.3 酶解時間對牦牛血液蛋白水解度的影響

將牦牛血用蒸餾水稀釋成蛋白質(zhì)濃度為8%的溶血液，在5%的酶濃度、溫度為55℃、pH為9.0、時間分別為2h、3h、4h、5h、6h的條件下進行酶解，然后測定酶解溶液的水解度[13]。

1.2.4 pH對牦牛血液蛋白水解度的影響

將牦牛血用蒸餾水稀釋成蛋白質(zhì)濃度為8%的溶血液，在5%的酶濃度、溫度為55℃、時間為4h、pH分別為8、9、10、11、12的條件下進行酶解，然后測定酶解溶液的水解

度[14]。

1.2.5 堿性蛋白酶水解血液蛋白的正交試驗

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇酶解溫度、酶濃度、時間、pH作為試驗因素，以血液蛋白水解度為指標(biāo)設(shè)計正交試驗[15]，采用L9（34）的正交試驗表研究堿性蛋白酶酶解牦牛血液蛋白的各種因素對水解度的影響，各因素均取3水平，試驗因素水平見表1。記錄實驗結(jié)果，利用SPSS和Origin2016軟件對實驗數(shù)據(jù)進行分析。

表1 正交試驗因素水平表

1.2.6 主要指標(biāo)測定方法

血液中總氮含量的測定：采用凱氏定氮法測定[16]。

式中：

X：試樣中蛋白質(zhì)的含量，單位為克每百克（g/100g）。

V1：試液消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，單位為毫升（mL）。

V2：試劑空白消耗硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液的體積，單位為毫升（mL）。

c：硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液濃度，單位為摩爾每升（mol/L）。

0.0140：1.0mL硫酸[c（1/2H2SO4）=1.000mol/L]或鹽酸[c（HCl）=1.000mol/L]標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，單位為克（g）。

M：試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。

V3：吸取消化液的體積，單位為毫升（mL）。

100：換算系數(shù)。

酶解液中氨基態(tài)氮含量的測定：采用甲醛電位滴定法測定[17]。

式中：

X：試樣中氨基酸態(tài)氮的含量，單位為克每百毫升（g/100mL）。

V1：測定用試樣稀釋液加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，單位為毫升（mL）。

V2：試劑空白實驗加入甲醛后消耗氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的體積，單位為毫升（mL）。

c：氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的濃度，單位為摩爾每升（mol/L）。

0.014：與1.00mL氫氧化鈉標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液[c（NaOH）=1.000mol/L]相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，單位為克（g）。

V：吸取試樣的體積，單位為毫升（mL）。

V3：試樣稀釋液的取用量，單位為毫升（mL）。

V4：試樣稀釋液的定容體積，單位為毫升（mL）。

100：單位換算系數(shù)。

水解度的計算：水解度（%）=（氨基酸態(tài)氮/樣品中總氮）×100[18]。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對血液蛋白水解度的影響

由圖1可知，當(dāng)溫度從40～55℃時，水解度隨著溫度的升高而不斷加大；當(dāng)溫度從55～60℃時，水解度隨溫度的升高而降低，且在55℃下出現(xiàn)最大水解度，故55℃設(shè)定為正交試驗的酶解溫度。溫度升高時，酶的催化速度加快，但酶蛋白變性失活的速度也在不斷增加，同時過高的溫度也會使底物蛋白發(fā)生變性，影響酶的催化速度[19]。

2.2 酶濃度對血液蛋白水解度的影響

由圖2可知，當(dāng)酶濃度從1%～5%時，水解度隨著酶濃度的升高而不斷加大；當(dāng)酶濃度大于5%時，水解度反而降低，故將5%設(shè)定為正交試驗的酶濃度添加量。酶濃度直接影響酶解過程的效率，酶濃度的增加一般可提高蛋白質(zhì)的水解度，但當(dāng)酶濃度大于最適濃度時，其作用效果不會明顯提高，甚至引起酶自溶增強，從而不利于酶解[20]。

2.3 時間對血液蛋白水解度的影響

由圖3可知，隨著酶解時間的延長，水解度不斷提高；當(dāng)時間超過4h時，水解度上升的不明顯，甚至略微下降，故4h設(shè)定為正交試驗中的酶解時間。酶解時間的延長能提高血液蛋白的水解度，但長時間的酶解過程中，酶會將氨基酸降解為生物胺類物質(zhì)，導(dǎo)致游離氨基態(tài)氮含量降低[21]。

2.4 pH對血液蛋白水解度的影響

由圖4可知，pH7-11時，隨著pH值增大，血液蛋白的水解度先升高后逐漸降低，當(dāng)pH為9時，水解度最高，故將9設(shè)定為正交試驗的pH值。pH值可改變酶與底物的荷電狀態(tài)，從而影響酶的活性。酶的最適pH值受酶的純度、底物的種類和濃度、緩沖劑的種類和濃度及抑制劑等因素的影響[22]。

2.5 堿性蛋白酶水解血液蛋白正交試驗和極差分析結(jié)果

堿性蛋白酶水解血液蛋白正交試驗和極差分析結(jié)果見表2。極差分析結(jié)果表明，時間對酶解液的水解度影響較大，各因素對水解度影響程度依次為時間、溫度、酶濃度、pH值。從K值可知較佳的工藝條件是A2B3C3D2，即酶解溫度55℃、酶濃度6%、時間5h、pH9.0，此條件下，血液蛋白的水解度可達21.32%。

表2

3 結(jié)語

本研究以無菌牛血為原料，利用堿性蛋白酶進行牛血的酶解工藝研究，以水解度為指標(biāo)，對酶解工藝中的溫度、酶濃度、時間和pH進行單因素試驗，并在此基礎(chǔ)上進行正交優(yōu)化試驗，得到優(yōu)化的酶解工藝條件為溫度55℃、酶濃度6%、時間5h，pH9.0，此時的水解度為21.32%。本研究探索了堿性蛋白酶水解血液蛋白的優(yōu)化酶解條件，為廢棄血液蛋白的處理提供了參考。