蘭科種子非共生萌發(fā)研究進(jìn)展

齊凌雲(yún)，周芳美

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭 310000）

蘭科植物可以通過(guò)種子培養(yǎng)進(jìn)行快速繁殖，雖然沒(méi)有功能胚乳，但是在自然條件下有適宜的共生菌參與可以進(jìn)行萌發(fā)，可是萌發(fā)率低、數(shù)量少。原始環(huán)境的毀壞和人為過(guò)度采挖，加之種子本身的萌發(fā)條件十分苛刻，致使野生資源在原始生境的恢復(fù)異常艱難，造成野生蘭科植物極度瀕危。研究表明，種苗快繁是實(shí)現(xiàn)瀕危蘭科植物資源再生和合理開(kāi)發(fā)利用的有效途徑，而種苗快繁技術(shù)的核心在于種子萌發(fā)[1]。目前大多采取人工接種共生真菌的方法來(lái)促使蘭花種子共生萌發(fā)；相比共生萌發(fā)，非共生萌發(fā)技術(shù)通過(guò)人為控制無(wú)菌環(huán)境，提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)使許多蘭科植物的萌發(fā)和繁殖更加可靠，是研究蘭科植物生長(zhǎng)發(fā)育的理想途徑。本文從蘭科種子的收集和預(yù)處理，對(duì)于其非共生萌發(fā)的處理和影響因素，以及使用非共生萌發(fā)的方法使其實(shí)現(xiàn)快速繁殖等方面的研究進(jìn)行綜合概括。

1 蘭科植物與非共生萌發(fā)

關(guān)于蘭科種子的繁育方法，非共生萌發(fā)不需要真菌的參與，操作過(guò)程簡(jiǎn)便，成本低，能在短期內(nèi)獲得大量的幼小植株大大增加了蘭科植物規(guī)模化培養(yǎng)的可行性，是有效、快速的繁育方法之一。目前對(duì)于蘭科種子非共生萌發(fā)體系的系統(tǒng)研究較少，而大多集中于利用不同種類的內(nèi)生菌來(lái)促進(jìn)蘭科種子的萌發(fā)，操作過(guò)程相對(duì)繁瑣，不利于實(shí)現(xiàn)蘭科植物的規(guī)模化繁殖。目前研究表蘭科植物的種子儲(chǔ)存方便，且蒴果種子容易消毒，污染率低，采用非共生萌發(fā)優(yōu)勢(shì)明顯。

1909年，Bernard以眉蘭屬的塊莖配制培養(yǎng)基，首次使卡德麗亞蘭與蕾麗亞蘭雜交種子成功萌發(fā)[2]。隨后，Arditt用非共生萌發(fā)法使不同類別的蘭花種子萌發(fā)，并成功培育出正常的種苗，其中有齒瓣蘭、石斛蘭、蝴蝶蘭、文心蘭、兜蘭等[3]。

蘭科種子實(shí)現(xiàn)非共生萌發(fā)的培養(yǎng)條件主要包括種子成熟度，溫度，光照，基本培養(yǎng)基的種類，植物激素（生長(zhǎng)素類、細(xì)胞分裂素及其濃度配比），氮源，碳源（蔗糖、果糖、葡萄糖、海藻糖等），活性炭的添加，天然有機(jī)物提取物（土豆汁、香蕉汁、椰汁等）等[1]。通過(guò)控制這些影響因素可以調(diào)節(jié)蘭科種子的萌發(fā)，使得蘭科種子的活力更強(qiáng)、萌發(fā)速度更快、萌發(fā)率更高。

2 種子的收集和預(yù)處理

2.1 種子的收集和保存

蘭科植物蒴果內(nèi)種胚的成熟度決定著蘭科植物的種子非共生萌發(fā)的萌發(fā)率，經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)種胚成長(zhǎng)到20周時(shí)開(kāi)始采集最好，這時(shí)種子含胚的概率最大，萌發(fā)率近乎100%，萌發(fā)所需時(shí)間為1周，且收集蒴果應(yīng)在種子成熟但果莢尚未開(kāi)裂前進(jìn)行。一般收集和有效保藏種子的方法是在超凈工作臺(tái)上，先將蒴果浸入70～75%乙醇中消毒30s，后使用2.5%NaCLO溶液進(jìn)行表面消毒15min，接著用無(wú)菌水沖洗數(shù)遍，隨后用無(wú)菌濾紙吸去殘留水分，最后使用無(wú)菌手術(shù)刀縱向切開(kāi)蒴果，取出種子待用。乙醇、NaClO溶液濃度和消毒時(shí)間的確定可根據(jù)蒴果大小等因素酌情調(diào)整，運(yùn)用的前后順序可視具體情況進(jìn)行改變[1]。

成熟蘭科植物的種子在含水量大且貯藏溫度高的環(huán)境下，易發(fā)霉變質(zhì)，失去生命力，貯藏時(shí)環(huán)境的溫度以及相對(duì)濕度越高，種子的退化速度就越快。在貯藏中，運(yùn)用低溫技術(shù)具有顯著抑制種子中微生物生長(zhǎng)的作用。微生物完成生命活動(dòng)的最適溫度是在21～27℃之間，低溫可以延長(zhǎng)種子的壽命，溫度降到0℃左右時(shí)，雖然仍有少量微生物能夠繼續(xù)發(fā)育，但其中大部分則是非常緩慢的。因而在貯藏種子時(shí)，應(yīng)將其裝入密封的塑料袋，放置在0～5℃的冰箱里。研究表明在播種前將種子放置于低溫黑暗環(huán)境中，有助于破壞種子休眠，從而提高萌發(fā)率。此外，種子的含水量多少同貯藏過(guò)程中影響種子生存的其他因素之間的關(guān)系是非常重要的。為實(shí)現(xiàn)種子的長(zhǎng)期儲(chǔ)藏需要排除各種有害因素，如種子含水量需小于9%，這樣可有效減緩種子的陳化過(guò)程。

2.2 種子的預(yù)處理

研究證實(shí)，種子經(jīng)過(guò)恰當(dāng)?shù)念A(yù)處理后可以有效提高種子的萌發(fā)率。這是由于有萌發(fā)抑制性物質(zhì)（如木質(zhì)素）存在于蘭科植物種子的種皮中，或是由于種皮自身妨礙了種子對(duì)氧氣及水分的吸收[1]。所以，為了促進(jìn)蘭科種子的萌發(fā)，實(shí)現(xiàn)蘭科植物的快速繁殖，現(xiàn)使用較多的種子預(yù)處理方法主要分為物理、化學(xué)和生物三個(gè)方面。

物理上普遍采用磁性棒攪拌或超聲波法消除這種由種皮產(chǎn)生的抑制作用。化學(xué)上則用KOH、NaOH、NaClO等溶液來(lái)破壞種皮并且達(dá)到消毒的效果。如劉思思等人發(fā)現(xiàn)用Ca（ClO）2劃破外種皮，之后在4～8℃下低溫層積8～12周可以提高陸生蘭種子的萌發(fā)率[1]；沈?qū)殱肗aOH溶液處理蘭科植物見(jiàn)血清種子推斷NaOH溶液的濃度及處理時(shí)間對(duì)種子萌發(fā)有極大的影響[4]。生物上可以用蝸牛酶等處理種子，沈?qū)殱龑?duì)見(jiàn)血清種子的試驗(yàn)表明適宜的蝸牛酶濃度在合適的處理時(shí)間下可明顯提高種子的萌發(fā)率，萌發(fā)率高于對(duì)照組，最高可達(dá)71.03%。除此之外，低溫層積也是常用的預(yù)處理方法之一。這些種子的預(yù)處理方式都可以不同程度的影響蘭科種子的萌發(fā)，對(duì)蘭科種子的非共生萌發(fā)以及快速繁殖的研究意義重大。

蘭科種子的胚發(fā)育不成熟，那么在萌發(fā)的過(guò)程中就無(wú)法提供充足的養(yǎng)分，致使種子萌發(fā)困難。在蘭科植物的無(wú)菌培養(yǎng)中對(duì)種子的合理處理可以大大提升種子的萌發(fā)速度和萌發(fā)率。采集和有效保存種子是實(shí)現(xiàn)蘭科植物種質(zhì)資源可持續(xù)利用的前提，種子的預(yù)處理更是可以促進(jìn)種子的快速萌發(fā)。找到有效的種子收集和預(yù)處理方式可以為珍貴藥用蘭科植物的快速繁殖帶來(lái)福音。

3 影響種子萌發(fā)的因素

蘭科種子非共生萌發(fā)的影響因素包括種子成熟度、溫度、光照、培養(yǎng)基種類和成分以及天然提取物等。

3.1 種子成熟度對(duì)種子萌發(fā)的影響

種子成熟度是影響種子萌發(fā)率的關(guān)鍵因素，在蘭科植物地生蘭中普遍存在未成熟種子的萌發(fā)率高于成熟種子的現(xiàn)象。Kaur S等人證明秀麗兜蘭未開(kāi)裂之前的蒴果的種子較開(kāi)裂后更易發(fā)芽[5]。其原因可能與不同時(shí)期種子種皮的機(jī)械阻力大小和透水透氣性、種胚發(fā)育程度、儲(chǔ)存的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量及可能存在的抑制物質(zhì)等有關(guān)。

3.2 溫度對(duì)種子萌發(fā)的影響

蘭科植物種子的培養(yǎng)溫度普遍保持在20～30℃，大多數(shù)以25℃為宜。通常情況下，蘭科植物種子在這個(gè)溫度范圍內(nèi)均能萌發(fā)，但不同種類的蘭科植物均有其最適的溫度區(qū)間，例如研究普遍認(rèn)為鐵皮石斛生長(zhǎng)的最適溫度為25℃左右。此外，在種子的預(yù)處理階段，研究表明將種子置于0～5℃或25℃的環(huán)境下保存一段時(shí)間，有助于打破種子休眠，提高萌發(fā)率且后者作用更顯著。華梅等人在對(duì)文山兜蘭種子非共生萌發(fā)的研究中發(fā)現(xiàn)種子在播種前經(jīng)過(guò)低溫處理73d后，文山兜蘭種子萌發(fā)時(shí)間可提前13d，萌發(fā)率達(dá)到59.33%[6]。

3.3 光照對(duì)種子萌發(fā)的影響

有資料顯示，蘭科植物種子的感光不是必需的而是光促進(jìn)類型。蘭科植物種子所需的光照周期因種而異，不同種類的種子有些需要全暗培養(yǎng)而有些則需要光暗交替培養(yǎng)，李雨晴的試驗(yàn)證明白及種子無(wú)菌萌發(fā)初期給予光照可提高萌發(fā)率，暗培養(yǎng)的白及種子萌發(fā)率顯著低于光照培養(yǎng)[7]。Philip等的試驗(yàn)證明黑暗條件可以促進(jìn)Calopogon tuberosus的種子萌發(fā)[8]。二者的研究同時(shí)表明當(dāng)種子發(fā)育到原球莖階段需給予適當(dāng)光照對(duì)幼苗的生長(zhǎng)和發(fā)育有益處。

3.4 培養(yǎng)基的種類、組分及培養(yǎng)方式對(duì)種子萌發(fā)的影響

3.4.1 基本培養(yǎng)基的種類對(duì)種子萌發(fā)的影響

通過(guò)查閱文獻(xiàn)整理出幾種不同類別蘭花的非共生萌發(fā)培養(yǎng)基配方，如表1所示。通常使用的培養(yǎng)基有MS、1/2MS、RE、KC（Kundson C）、花寶 （Hyponex）等，不同蘭花種子在不同培養(yǎng)基上萌發(fā)率存在著一定差異。據(jù)研究表明，MS或者1/2MS培養(yǎng)基具有無(wú)機(jī)鹽和離子濃度較高、溶液離子平衡相對(duì)穩(wěn)定、養(yǎng)分含量及比例適宜等特點(diǎn)，能夠迎合蘭科植物的營(yíng)養(yǎng)以及生理需求，故其應(yīng)用較其他基礎(chǔ)培養(yǎng)基更多。

表1 幾種蘭花非共生萌發(fā)的培養(yǎng)基配方

3.4.2 培養(yǎng)方式

蘭科植物非共生萌發(fā)利用的培養(yǎng)基是由人工配制的，促進(jìn)和保障植物組織生長(zhǎng)的養(yǎng)料。按照培養(yǎng)基的物理狀態(tài)可將其分為固體和液體兩種類型。固體培養(yǎng)的轉(zhuǎn)接次數(shù)少，節(jié)約勞力和設(shè)備投入。然而有研究表明，液體懸浮培養(yǎng)通過(guò)與蘭科種子充分接觸更有助于種子萌發(fā)，表現(xiàn)在種子萌發(fā)提前，原球莖顏色翠綠且形態(tài)飽滿，生長(zhǎng)速度快，同時(shí)在液體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)不易分化。華梅等人在對(duì)文山兜蘭種子非共生萌發(fā)的研究中發(fā)現(xiàn)文山兜蘭種子在液體懸浮培養(yǎng)基中無(wú)論萌發(fā)時(shí)間還是萌發(fā)率上都明顯優(yōu)于固體培養(yǎng)基，并且以花寶1號(hào)作為培養(yǎng)基能明顯提高萌發(fā)率[6]。Thompson等開(kāi)創(chuàng)性地采用雙相培養(yǎng)基，以增進(jìn)南非Disa屬的蘭花不成熟種子萌發(fā)，培養(yǎng)基由富含活性炭的固態(tài)培養(yǎng)基和覆蓋在其上的降低強(qiáng)度的相同類型的液體培養(yǎng)基構(gòu)成。前者用來(lái)消彌過(guò)濾后的苯酚的影響而且使得原球莖形成極性，并且后者能有效增強(qiáng)水的利用。相比舊的培養(yǎng)方法，種子萌發(fā)的速度更快，而且許多種類的種子萌發(fā)率接近于它們的估計(jì)萌發(fā)潛力[13]。

3.5 天然提取物與活性炭對(duì)種子萌發(fā)影響

天然提取物如香蕉勻漿、椰子汁等含有氨基酸、激素和酶等的有機(jī)物，是成分相對(duì)復(fù)雜的天然復(fù)合物，添加適宜種類和濃度的天然提取物對(duì)種子的萌發(fā)有顯著的促進(jìn)作用，這一結(jié)論已有諸多論證。然而，如果培養(yǎng)基中添加了不適宜的天然提取物，不但不會(huì)促進(jìn)萌發(fā)，甚至?xí)?lái)不利影響，如唐麗等人對(duì)鐵皮石斛的研究中發(fā)現(xiàn)適量馬鈴薯可以促進(jìn)種子萌發(fā)而添加椰乳則對(duì)其有不利影響[14]。

活性炭能吸附分泌到培養(yǎng)基中的抑制性的和有害的物質(zhì)，對(duì)抑制褐變有顯著作用，這樣可以大大減少已萌發(fā)種子的死亡率，但由于活性炭也有副作用，即活性炭的加入常使培養(yǎng)基的成分變得復(fù)雜，因此在培養(yǎng)時(shí)需根據(jù)物種選擇是否添加。

綜合上述影響因素，通過(guò)對(duì)種子進(jìn)行預(yù)處理，合理控制溫度和光照等因素，選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)方式，優(yōu)化改良培養(yǎng)基配方能夠有效促進(jìn)種子萌發(fā)。

4 問(wèn)題與展望

非共生萌發(fā)是植物快速繁殖的一種方式，相比于自然環(huán)境下生長(zhǎng)的植物，它能夠避免人為和自然的災(zāi)害，保持穩(wěn)定的生長(zhǎng)，進(jìn)而讓珍稀植物保持一定的數(shù)量，被人們所利用，但是目前的技術(shù)還不能夠廣泛應(yīng)用，仍存在以下問(wèn)題：第一，實(shí)驗(yàn)對(duì)環(huán)境要求嚴(yán)苛，過(guò)程中需要保證無(wú)菌環(huán)境。第二，在有效保存種子的問(wèn)題上，需要嚴(yán)格控制好試劑用量以及貯存條件。第三，蘭科種子的胚發(fā)育不完全，在萌發(fā)過(guò)程中要提供足夠的養(yǎng)分以及合適的處理。

珍稀蘭科植物具有很高的藥用價(jià)值，隨著對(duì)蘭科植物的需求不斷增加，其數(shù)量因自然與人為因素的制約逐漸無(wú)法滿足需求，人們也很少在珍稀蘭科植物的快速繁殖上開(kāi)展大量工作。今后，人們對(duì)于藥材的培養(yǎng)與保護(hù)會(huì)更加重視，更多的創(chuàng)新技術(shù)會(huì)在這個(gè)領(lǐng)域應(yīng)用和體現(xiàn)。讓蘭科植物實(shí)現(xiàn)快速繁殖，提高藥材的數(shù)量和品質(zhì)，能夠在資源保存和獲取方面取得重大突破，展現(xiàn)出無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)與前景，開(kāi)拓了廣闊的市場(chǎng)。因?yàn)樘m科植物在自然環(huán)境下的生長(zhǎng)遭到阻礙，所以需要依靠非共生萌發(fā)技術(shù)，幫助其發(fā)育成長(zhǎng)，這將會(huì)對(duì)醫(yī)藥學(xué)事業(yè)做出巨大貢獻(xiàn)。