豚草提取液對錦鯉及小白鼠安全性測定

張欣倩，包 穎，陳 贊，王曉紅，趙 楊

(1.淄博市林業(yè)科學(xué)研究所，山東 淄博 255000；2.吉林省林業(yè)技術(shù)推廣站，吉林 長春 130022；3淄博潤豐原生態(tài)環(huán)境工程有限公司，山東 淄博 255000；4.淄博市野生動植物保護(hù)站，山東 淄博 255000)

豚草(Ambrosiaartemisiifolia)又名艾葉破布草，屬菊科(Compositae)、豚草屬(Ambrosia)植物，常生于荒地、路邊、水溝旁或農(nóng)田中。以種子隨作物、水流及交通工具攜帶進(jìn)行傳播。豚草適應(yīng)能力強，由于生長旺盛，所以對水和營養(yǎng)的消耗量很高，當(dāng)其形成一定的長勢后，會對其他人類種植的作物產(chǎn)生壓制作用，若不及時清除，還會對農(nóng)業(yè)操作產(chǎn)生阻礙，對農(nóng)業(yè)環(huán)境和人類健康均有害[1,2]。

生物農(nóng)藥是指可以用來防治有害生物的生物體本身或者是源自生物體中各種對有害生物具有一定類似“農(nóng)藥”生理活性的物質(zhì)[3]。目前人們習(xí)慣把生物農(nóng)藥分為：植物源農(nóng)藥、動物源農(nóng)藥、微生物源農(nóng)藥三大類[4]。植物源農(nóng)藥作為一種生物農(nóng)藥，對環(huán)境破壞小，對靶標(biāo)以外的生物具有毒性低、安全性，并且不易產(chǎn)生抗藥性，由于來源于植物活性成分，所以這類生物農(nóng)藥在施用后能快速自然降解[5]。植物源農(nóng)藥包括植物體內(nèi)的次生代謝物質(zhì)和轉(zhuǎn)基因植物農(nóng)藥[6]，目前研究普遍認(rèn)為這些次生代謝產(chǎn)物對非靶標(biāo)生物相對安全[4]。

近年來，一些學(xué)者嘗試對豚草活性成分進(jìn)行提取，并用其提取液對害蟲進(jìn)行實驗室毒力試驗，發(fā)現(xiàn)豚草提取液具有一定的殺蟲抑菌活性[7]。本文以豚草為原料，采用超聲波法提取活性物質(zhì)，選擇錦鯉和小白鼠為急性毒性試驗對象，為豚草植物源制劑對動物的作用提供安全依據(jù)。

1試驗材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1供試植物

豚草，平均株高60 cm，平均含水率79.37 %。

1.1.2供試哺乳動物

小白鼠，體重17～22 g。

1.1.3供試魚

錦鯉，體長4 cm左右。

1.2試驗方法

采集新鮮豚草全株并洗凈，將其陰干，置于干燥箱內(nèi)50 ℃烘干，粉碎后置于棕色廣口瓶中。選取300 mL錐形瓶，稱取豚草干粉10 g和80 %的乙醇100 mL放入瓶中并封口，將混合液在40 ℃下超聲波振蕩45 min。抽濾超聲波處理后的混合物，所得殘渣經(jīng)干燥后，稱其質(zhì)量。將濾液轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至油狀，用蒸餾水定容到50 mL，4 ℃避光保存。

1.2.1豚草粗提液對小白鼠安全性測定方法

正式試驗前首先進(jìn)行預(yù)試驗，找出引起白鼠0 %和100%死亡的劑量，以便安排正式試驗。正式試驗選用健康小白鼠，性別相同或雌雄各半，采用胃腸給藥，每只受試小白鼠喂藥前稱體重，記錄體重數(shù)據(jù)并算出平均體重，本試驗小白鼠平均體重為22.35 g。在預(yù)試驗測得的劑量范圍內(nèi)設(shè)5個劑量組。本研究通過預(yù)試驗確定正式試驗的五個劑量組分別為1 mL、2 mL、3 mL、4 mL和5 mL。每個劑量設(shè)10只小白鼠，3次重復(fù)，并設(shè)置一個對照組。對受試小白鼠分組灌服不同劑量。給藥后24 h內(nèi)對照組與受試組同樣不喂食，不喂水，24 h后記錄死亡率。

1.2.2豚草粗提液對錦鯉安全試驗測定方法

正式試驗前先進(jìn)行預(yù)試驗，通過預(yù)試驗找出引起紅錦鯉0 %和100 %死亡的劑量，以便正式試驗在此范圍內(nèi)設(shè)置不同的劑量組。預(yù)試驗中每個濃度設(shè)3次重復(fù)，5條一組。根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，設(shè)置了5個劑量組，將不同劑量粗提液裝入容器中，然后將錦鯉放入進(jìn)行觀察，每個容器中都放置加氧泵，間隔2 h記錄死亡數(shù)，共觀察48 h，及時取出死亡個體，計算死亡率。試驗從中間劑量開始，從錦鯉受藥反應(yīng)判斷劑量和組數(shù)是否合適，以便調(diào)整。

2結(jié)果與分析

2.1 豚草提取液活性成分提取率

活性成分的提取率計算采用差值法，公式如下：提取率=(原干粉質(zhì)量-提取后殘渣質(zhì)量)/原干粉質(zhì)量×100 %，由試驗數(shù)據(jù)可以看出，超聲波提取法提取率為22.16 %(見表1)。

表1 超聲波提取法對豚草活性成分的提取率

2.2 豚草提取液對小白鼠急性毒性

小白鼠急性毒性試驗結(jié)果如表2所示，豚草提取液對小白鼠的半致死劑量為2.515 mL，LD50為4 986.396 mg·kg-1。根據(jù)我國現(xiàn)行農(nóng)藥毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，豚草活性物質(zhì)對白鼠的LD50=4 986.396 mg·kg-1>500 mg·kg-1，在低毒范疇。

表2 豚草提取藥液對小白鼠急性毒性測定結(jié)果

分析濃度對數(shù)與死亡機(jī)率值間的相關(guān)性得出，R2=0.962 9，相關(guān)性密切?；貧w方程為y=3.261 1x-7.059。劑量越大，白鼠的死亡率越高，兩者呈正相關(guān)(見圖1)。

圖1 豚草粗提液對小白鼠急性毒性試驗毒力回歸線

2.3豚草提取藥液對錦鯉安全測定結(jié)果

受試錦鯉在給藥后，產(chǎn)生明顯的中毒癥狀，加速游動，活動較正常時更為劇烈。

表3 豚草粗提液對紅鯉魚急性毒性測定結(jié)果

從表3中可以看出，豚草粗提物對紅鯉魚的致死中濃度LC50為350.262 μg·mL-1，濃度對數(shù)與死亡機(jī)率值間的相關(guān)性分析得出，R2=0.987，相關(guān)性密切?；貧w方程為y=1.866 6x+0.250 7(見圖2)。

圖2 豚草粗提液對紅鯉魚急性毒性試驗線性直線

根據(jù)我國現(xiàn)行農(nóng)藥對魚類的毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，豚草活性物質(zhì)對錦鯉LC50=350.262 μg·mL-1=350.262 mg·L-1>10 mg·L-1，低毒。

3結(jié)論與討論

LD50即致死中量，為衡量農(nóng)藥毒性的重要指標(biāo)，根據(jù)LD50大小即可劃分農(nóng)藥的毒性等級，本研究結(jié)果表明：豚草提取液對小白鼠經(jīng)口腸胃給藥后的LD50為4 986.396 mg·kg-1，屬于低毒范疇。

豚草稀釋液對錦鯉急性毒性試驗表明：豚草提取液對錦鯉LC50為350.262 mg·L-1，根據(jù)我國現(xiàn)行農(nóng)藥毒性分級標(biāo)準(zhǔn)可以確定，屬于低毒范疇，對環(huán)境幾乎無害，對人、畜安全性較高，可在林木有害生物防治工作中進(jìn)一步驗證并推廣。