響應(yīng)面優(yōu)化水–乙醇法提取云南咖啡生豆綠原酸工藝研究

楊剴舟，翟曉娜，欒 霞，郭咪咪，李秀娟，段章群?

（1. 國(guó)家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京 100037；2. 農(nóng)業(yè)部規(guī)劃設(shè)計(jì)研究院，北京 100121）

綠原酸是由肉桂酸（咖啡酸、阿魏酸以及香豆酸）和奎寧酸酯化所形成的一類酚酸類化合物，是植物在有氧呼吸過(guò)程中經(jīng)桂皮酸途徑所產(chǎn)生的一類苯丙素類化合物[1]，具有良好的生理活性，有抗氧化、抗菌抗炎、抗高血壓、保護(hù)心血管和調(diào)節(jié)糖脂代謝等生理功能[2-6]。綠原酸在自然界中廣泛存在，其中在咖啡、金銀花和杜仲中含量相對(duì)較高，綠原酸在阿拉比卡和羅布斯塔咖啡生豆中含量分別為3.4%～4.8%和7.9%～14.4%[7]。云南作為我國(guó)咖啡的主產(chǎn)區(qū)，其種植和產(chǎn)量占全國(guó)的98%以上[8]，從云南咖啡豆提取綠原酸不僅原料來(lái)源豐富，而且可以大大提高咖啡豆的附加值，對(duì)于國(guó)內(nèi)咖啡產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效具有重要意義。

常見(jiàn)的綠原酸單體主要包括6種咖啡?？鼘幩?，分別是3-咖啡?？鼘幩幔?-CQA）、4-咖啡?？鼘幩幔?-CQA）、5-咖啡?？鼘幩幔?-CQA）、3,4-雙咖啡?？鼘幩幔?,4-DICQA）、3,5-雙咖啡酰奎寧酸（3,5-DICQA）和 4,5-雙咖啡?？鼘幩幔?,5-DICQA），以及3種阿魏酸奎寧酸，分別是3-阿魏?？鼘幩幔?-FQA）、4-阿魏?？鼘幩幔?-FQA）與5-阿魏酰奎寧酸（5-FQA）[7]。單咖啡（阿魏）?？鼘幩幔–QA和FQA）易溶于水、醇和丙酮等試劑，而雙咖啡?？鼘幩幔―ICQA）則易溶于乙醚、三氯甲烷等非極性溶劑中[9]，因此提取溶劑的選擇較為重要。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于綠原酸的提取研究大多集中在水提法[10]、醇提法[11]、水–乙醇法[12]、超聲法[13]、微波法[14]、酶法[15]、超高壓法[16]等，但是從實(shí)際生產(chǎn)操作來(lái)看，超聲法、微波法、酶法以及超高壓法等提取方法存在著設(shè)備投入大、應(yīng)用成本較高以及大多仍處于實(shí)驗(yàn)室階段等問(wèn)題。水提法和醇提法由于單溶劑體系溶劑極性的限制，并不能將9種綠原酸單體完全有效的萃取出來(lái)；此外目前研究報(bào)道中大多只研究單一綠原酸單體（5-CQA）的提取[17-18]，忽視了其余8種綠原酸異構(gòu)體提取變化規(guī)律，從而造成了物料的浪費(fèi)和成本的提升。

基于上述原因本文選用云南卡蒂姆咖啡生豆為原料，以高效液相色譜對(duì)9種綠原酸異構(gòu)體進(jìn)行分析，首先采用水–乙醇法對(duì)綠原酸的提取工藝進(jìn)行研究，并結(jié)合水提法進(jìn)行對(duì)比，然后采用響應(yīng)面法優(yōu)化水–乙醇法咖啡生豆提取工藝，目的是獲得水–乙醇法提取咖啡生豆綠原酸的最佳工藝，為云南咖啡豆的綜合開(kāi)發(fā)利用和咖啡產(chǎn)業(yè)提質(zhì)增效提供一條重要途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

卡蒂姆咖啡豆，品種阿拉比卡：購(gòu)買(mǎi)于云南普洱；綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品 5-CQA（≥98%）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司；3-CQA、4-CQA、3-FQA、4-FQA、5-FQA、3,4-DICQA、3,5-DICQA、4,5-DICQA（≥98%）：成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司；亞鐵氰化鉀（K4Fe(CN)6·3H2O）、二水合乙酸鋅（CH3COO）2Zn·2H2O）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；甲酸，乙醇，乙腈等試劑為色譜純。

1.2 儀器與設(shè)備

R220咖啡研磨機(jī)：日本皇家富士；LC-20AT高效液相色譜儀：日本島津；自動(dòng)進(jìn)樣器：日本島津 SIL-20AC；TGL-20M 高速離心機(jī)：長(zhǎng)沙平凡儀器儀表有限公司；超純水制備機(jī)器：美國(guó)Milli-Q；恒溫水浴鍋：電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1.1 物料目數(shù)對(duì)綠原酸提取率的影響 稱取物料目數(shù)分別為 20、40、60、80、100目下的咖啡粉 10.0 g按照液料比 20∶1加入超純水，在90 ℃水浴中提取15 min，考察不同物料目數(shù)對(duì)綠原酸提取率的影響。

1.3.1.2 液料比對(duì)綠原酸提取率的影響 稱取物料目數(shù)為60目的咖啡粉10.0 g，分別按液料比為10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1 加入去離子水，在90 ℃水浴中提取15 min，考察液料比對(duì)綠原酸提取率的影響。

1.3.1.3 水提溫度對(duì)綠原酸提取率的影響 稱取物料目數(shù)為 60目的咖啡粉 10.0 g，按照液料比20:1加入去離子水，分別在60、70、80、85、90、95、100 ℃下提取咖啡豆中綠原酸15 min，考察水提溫度對(duì)綠原酸提取率的影響。

1.3.1.4 提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響 稱取物料目數(shù)為 60目的咖啡粉 10.0 g，按照液料比20∶1加入去離子水，在90 ℃下分別提取咖啡豆中綠原酸5、10、15、20、25 min，考察提取時(shí)間對(duì)綠原酸提取率的影響。

1.3.1.5 醇濃度對(duì)綠原酸提取率的影響 根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道乙醇–水的混合溶劑最佳提取溫度為60 ℃。稱取物料目數(shù)為60目的咖啡粉10.0 g，在液料比1∶20，在60 ℃下以混合溶劑中醇濃度分別為0%、20%、40%、60%、80%、100%對(duì)咖啡豆中綠原酸進(jìn)行提取15 min，考察不同乙醇濃度對(duì)綠原酸提取率的影響。

1.3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.3 綠原酸分析檢測(cè)

1.3.3.1 綠原酸待測(cè)液的制備 按照上述條件來(lái)制備咖啡提取液，在5 000 rpm下離心5 min；取上層濾液4 mL，加入100 μL CarrezⅠ試劑（亞鐵氰化鉀，250 mmol/L），100 μL CarrezⅡ試劑（二水合乙酸鋅，1 mmol/L），800 μL甲醇，充分震蕩混勻，靜置10 min以沉淀蛋白；最后5 000 rpm，10 min離心取上層液過(guò)膜置于4 ℃冰箱備用[19]。

1.3.3.2 液相色譜條件 色譜柱為 C18反相柱(250 mm×4.6 mm, 4 μm，孔徑 80 ? )，流動(dòng)相 A為超純水，流動(dòng)相B為1%甲酸–乙腈，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)325 nm，柱溫25 ℃，流速1.0 mL/min；梯度洗脫程序：0 min時(shí)，流動(dòng)相A和B比例95:5；線性增加到60 min時(shí)，流動(dòng)相A和B比例75:25；自動(dòng)進(jìn)樣器設(shè)置為4 ℃，進(jìn)樣量10 μL[20]?？Х壬咕G原酸組成液相色譜圖如圖1所示。

綠原酸提取率（%）計(jì)算公式如下所示：

1.3.3.3 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取綠原酸（5-CQA）標(biāo)品1.000 g置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到10 mg/mL的標(biāo)品儲(chǔ)備液。吸取儲(chǔ)備液0、100、200、300、400、500、1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 μL 分別置于7個(gè)10 mL容量瓶中，用甲醇定容混勻，配成0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL的11個(gè)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.3.3.2中的色譜條件依次進(jìn)樣10 μL測(cè)定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)，綠原酸標(biāo)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算得線性回歸方程為：y= 33 275 600x–12 342（R2= 0.999 8）。結(jié)果表明，在 0.1 ～3.0 mg/mL范圍內(nèi)，峰面積與濃度線性關(guān)系良好（如圖2所示）。

圖1 咖啡豆綠原酸液相色譜圖

圖2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3次，采用SPSS（Vision 22.0，IBM）和Design-Expert 8.05軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 物料目數(shù)

由圖 3中可以看出，隨著物料目數(shù)的增加，咖啡生豆的綠原酸提取率呈現(xiàn)先線性增加后基本不變的趨勢(shì)，在60目時(shí)提取率基本達(dá)到平衡，約為4.0%，主要原因是在20～60目過(guò)程中，在提取傳質(zhì)過(guò)程中與水接觸比表面積越大，綠原酸越易溶解出來(lái)；當(dāng)溶劑和溶質(zhì)傳質(zhì)達(dá)到平衡時(shí)，綠原酸就不再滲透溶解出來(lái)，因此提取率基本不再變化。Rohit Upadhyay等[14]采用物料目數(shù)大于25目（＜720 μm＝的羅布斯塔咖啡生豆粉在微波功率800 W、提取溫度50 ℃、微波時(shí)間10 min下的綠原酸提取率為 6.35%，主要原因是作者采用醋酸鉛沉降法測(cè)定綠原酸含量會(huì)造成測(cè)定結(jié)果偏高，此外羅布斯塔豆綠原酸含量相對(duì)高于阿拉比卡豆。綜合考慮，選擇物料目數(shù)60目進(jìn)行綠原酸提取率的下一步研究。

圖3 物料目數(shù)對(duì)咖啡生豆綠原酸提取率的影響

2.1.2 液料比

由圖4中可以看出，隨著液料比的逐漸增加，咖啡生豆的綠原酸提取率呈現(xiàn)先增加后基本不變的趨勢(shì)，在液料比20∶1時(shí)提取率基本達(dá)到平衡，與饒建平等[10]報(bào)道的結(jié)論一致。酚類物質(zhì)的提取在一定程度上與溶劑和溶質(zhì)的比例有關(guān)，當(dāng)傳質(zhì)平衡時(shí)溶解到溶劑中的溶質(zhì)不再變化，進(jìn)一步提高傳質(zhì)效率還要考慮溶劑的類型，一般來(lái)講極性和非極性共存的混合溶劑提取效率更高，后續(xù)我們將會(huì)對(duì)醇濃度對(duì)于提取率的影響進(jìn)行研究。綜合考慮，選擇液料比20∶1進(jìn)行綠原酸提取率的下一步研究。

圖4 液料比對(duì)咖啡生豆綠原酸提取率的影響

2.1.3 水提溫度

由圖 5中可以看出，隨著水提溫度的逐漸增加，咖啡生豆的綠原酸提取率呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在95 ℃時(shí)達(dá)到最大，約為4.30%。在綠原酸提取過(guò)程中，隨著溫度的增加，傳質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)急劇增加，綠原酸大量從咖啡細(xì)胞中溶出，使得綠原酸提取率直線增加；當(dāng)溫度達(dá)到 100 ℃時(shí)，綠原酸由于存在大量的酯鍵、雙鍵和酚羥基基團(tuán)，在長(zhǎng)時(shí)間處于高溫下時(shí)易發(fā)生分解、氧化和異構(gòu)化等變化，導(dǎo)致提取率降低。有研究報(bào)道[10]當(dāng)溫度 90 ℃時(shí)，綠原酸提取率就開(kāi)始降低，與我們的研究結(jié)果一致，但我們的研究在 95 ℃時(shí)綠原酸的提取率又出現(xiàn)了升高，這可能的原因是1個(gè)雙咖啡?？鼘幩岬慕到獬?2個(gè)單咖啡?？鼘幩幔黾恿司G原酸的整體含量。綜合考慮，選擇水提溫度95 ℃進(jìn)行綠原酸提取率的下一步研究。

圖5 水提溫度對(duì)咖啡生豆綠原酸提取率的影響

2.1.4 提取時(shí)間

由圖 6中可以看出，隨著提取時(shí)間的逐漸增加，咖啡生豆的綠原酸提取率在5～15 min內(nèi)隨著時(shí)間的增加而增加，而在15～30 min內(nèi)隨著時(shí)間增加則呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢(shì)。主要原因是綠原酸在咖啡細(xì)胞中和水溶液中的傳質(zhì)在15 min達(dá)到平衡以及長(zhǎng)時(shí)間的高溫提取導(dǎo)致綠原酸的氧化分解，因此在高溫下的提取時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。綜合考慮，選擇提取時(shí)間15 min進(jìn)行綠原酸提取率的下一步研究。

圖6 提取時(shí)間對(duì)咖啡生豆綠原酸提取率的影響

綜上所述，在純水體系下，綠原酸提取率的較佳工藝為物料目數(shù)60目，液料比20∶1，水提溫度95 ℃，提取時(shí)間15 min，綠原酸提取率為4.29%。

2.1.5 醇濃度

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，提取溶劑中含有一定比例的乙醇可能會(huì)提高綠原酸的提取率，但是對(duì)于最佳綠原酸提取率的醇濃度比例并不一致[11-12,17-18]；同時(shí)乙醇-水的混合溶劑最佳提取溫度大約在60 ℃[11,17]左右，因此我們?cè)诖继釡囟?0 ℃，物料目數(shù) 60目，液料比 20∶1，提取時(shí)間 15 min下對(duì)不同醇濃度對(duì)于綠原酸提取率進(jìn)行了研究，結(jié)果如圖7所示。

圖7 醇濃度對(duì)咖啡生豆綠原酸提取率的影響

從圖中可以看出，從純水到純乙醇，綠原酸的提取率出現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，其中醇濃度在20%～60%范圍內(nèi)提取率相差不大，40%時(shí)相對(duì)較高，為 5.21%，比純水溶劑體系下提取率高約21%，比文獻(xiàn)報(bào)道中的純水體系和聚二乙醇體系（60 ℃，40%醇濃度）下[11,17]的提取率高60%和280%，主要原因在于報(bào)道中只研究了 5-CQA的提取率，此外純水體系難以把弱極性的雙咖啡酰奎寧酸萃取出來(lái)[20]；而在 80%和 100%高醇濃度時(shí)，綠原酸提取率只有 2%和 1.5%左右，與同溫度下的純水體系基本一致，并沒(méi)有起到提高傳質(zhì)效率的目的，主要原因是混合溶劑的極性，作為綠原酸主要單體的5-CQA易溶于水，極性較大，而乙醇的極性小于水，在高醇體系下對(duì)于5-CQA的萃取量降低，從而造成提取率降低。

我們同時(shí)對(duì)文獻(xiàn)報(bào)道中[11,17]的最佳醇提溫度進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如圖8所示。研究發(fā)現(xiàn)與文獻(xiàn)報(bào)道一致，在60 ℃時(shí)綠原酸提取率達(dá)到最高。

圖8 醇提溫度對(duì)咖啡生豆綠原酸提取率的影響

綜上所述，在單因素實(shí)驗(yàn)中，綠原酸較佳的提取工藝條件為：醇提溫度60 ℃，醇比例40%，物料目數(shù)60目，液料比20∶1，提取時(shí)間15 min，綠原酸提取量為5.21%。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.05軟件進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，根據(jù) Box-Behnken（BBD）中心組合設(shè)計(jì)原理，選取提取時(shí)間A、液料比B和醇濃度C三個(gè)對(duì)綠原酸提取率影響顯著的因素作為自變量，以綠原酸提取率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，研究提取時(shí)間、液料比和醇濃度對(duì)生豆中綠原酸提取率的影響。實(shí)驗(yàn)因素水平表與實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1～2所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表

表2 綠原酸提取響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用Design-Expert 8.05軟件對(duì)表2中綠原酸提取率的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到綠原酸提取率對(duì)自變量A、B、C的二次多項(xiàng)式回歸方程：

Y=5.22–0.045A–0.16B–0.26C–0.055AB+0.35A C+0.16BC–0.41A2–0.26B2–0.35C2

回歸方程方差分析和回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表 3。由表 3可知，綠原酸提取率模型的判定系數(shù)R2=0.975 7，P＜0.000 1，此模型高度顯著，絕對(duì)平均偏差（4.74%）也相對(duì)較低，說(shuō)明模型預(yù)測(cè)結(jié)果的重復(fù)性良好；此外較高的調(diào)整判定系數(shù)（0.944 4）和失擬項(xiàng)不顯著（0.051 3）也說(shuō)明了不確定因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾較小，模型擬合程度良好，此模型能很好解釋綠原酸提取率響應(yīng)值的變化，可以用于預(yù)測(cè)綠原酸提取過(guò)程中實(shí)際情況。模型回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)表明，一次項(xiàng)系數(shù)B和C即液料比和醇濃度對(duì)生豆綠原酸提取率影響都顯著，交互項(xiàng)AC、BC和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)生豆綠原酸提取率具有顯著性影響。

表3 生豆綠原酸提取率回歸方程方差分析表

2.2.2 響應(yīng)面分析

圖9表示的是固定液料比為20∶1下，提取時(shí)間和醇濃度及其交互作用對(duì)綠原酸提取率的影響。最大的綠原酸提取率出現(xiàn)在提取時(shí)間為10～14 min和醇濃度20%～28%范圍內(nèi)，隨著提取時(shí)間和醇濃度的增加，綠原酸提取率出現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，這與陳魏[22]等的研究結(jié)論相一致。

圖9 提取時(shí)間和醇濃度及其交互作用對(duì)綠原酸提取率的影響

圖10表示的是提取時(shí)間為15 min下，液料比和醇濃度及其交互作用對(duì)綠原酸提取率的影響。最大的綠原酸提取率出現(xiàn)在液料比為15∶1～19∶1和醇濃度20%～28%范圍內(nèi)，隨著液料比和醇濃度的增加，綠原酸提取率出現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，液料比的增加不但會(huì)造成提取時(shí)間和醇濃度的增加，還會(huì)造成綠原酸提取率的降低。這與唐薇[23]和饒建平[10]等的研究結(jié)論相一致，主要原因可能是在水醇體系下，隨著液料比的增加，體系中其他物質(zhì)隨之溶出，與綠原酸產(chǎn)生了競(jìng)爭(zhēng)性溶出現(xiàn)象；而在高醇體系下由于混合溶劑的極性降低，造成綠原酸主要單體的5-CQA溶解度降低，因此造成綠原酸得率降低。

圖10 液料比和醇濃度及其交互作用對(duì)綠原酸提取率的影響

2.2.3 反應(yīng)條件優(yōu)化及模型驗(yàn)證

以綠原酸提取率作為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面軟件對(duì)水–乙醇法提取綠原酸實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)最優(yōu)化分析，考慮到實(shí)際生產(chǎn)中成本和溶劑損耗，最終得到最佳提取時(shí)間11.67 min，液料比16.07∶1，醇濃度20.16%，綠原酸提取率5.27%。

對(duì)上述最優(yōu)化條件進(jìn)行 3次平行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，綠原酸提取率分別為5.30%、5.35%和5.29%, 平均得率 5.31%。實(shí)驗(yàn)值和預(yù)測(cè)值具有良好的相關(guān)性, 說(shuō)明該響應(yīng)面模型和最優(yōu)化條件是有效的。

3 結(jié)論

以云南卡蒂姆咖啡豆為原料，采用水–乙醇法首次對(duì)9種綠原酸異構(gòu)體進(jìn)行提取研究。通過(guò)單因素和響應(yīng)面優(yōu)化得到的水–乙醇法提取綠原酸的最佳工藝條件為：醇提溫度 60 ℃，提取時(shí)間11.67 min，物料目數(shù)60目，液料比16.07∶1，醇濃度20.16%，綠原酸提取率5.31%。本研究對(duì)9種綠原酸異構(gòu)體的提取效果進(jìn)行研究，相比較先前研究只對(duì)5-CQA提取率進(jìn)行研究，更能全面反映綠原酸的提取效果，綠原酸得率也更高。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫(kù)下載獲取。