褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)制研究進(jìn)展

李 謙，胡 富，寧利敏，朱本偉，倪 芳，姚 忠

(1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800；3.南京中醫(yī)藥大學(xué) 醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 南京 210023)

褐藻膠主要是由褐藻以及細(xì)菌產(chǎn)生的一種酸性多糖，是褐藻門植物如海帶(Saccharinajaponica)、裙帶菜(Undariapinnatifida)等細(xì)胞壁的主要成分[1]。褐藻膠主要由兩個(gè)單體組成，β-D-甘露糖醛酸(M)以及它的C5差向異構(gòu)體，α-L-古羅糖醛酸(G)。各個(gè)單體之間通過1,4-糖苷鍵相連，可以形成均聚甘露糖醛酸片段(polyM)、均聚古羅糖醛酸片段(polyG)以及兩個(gè)單體交替連接形成雜合片段(polyMG)[2]。褐藻膠具有多種生物活性，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)，但是由于其具有分子量大、水溶性差及生物利用度低的缺點(diǎn)，極大地限制了其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用[3]?？梢圆捎妹附獾姆椒▽⑵浣到鉃楹衷迥z寡糖，褐藻膠寡糖保持了多糖所具有的抗腫瘤、促進(jìn)生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)免疫等功效，更是由于水溶性好和生物利用度高，受到了國(guó)內(nèi)外研究者的關(guān)注[4]。

褐藻膠裂解酶屬于多糖裂解酶家族，通過β消除來降解褐藻膠。褐藻膠裂解酶的來源主要有①海洋細(xì)菌、土壤細(xì)菌、噬菌體以及真菌等微生物；②海洋藻類；③海洋棘皮動(dòng)物以及軟體動(dòng)物[5]。目前對(duì)褐藻膠裂解酶的分類方法大致有以下幾種方式：根據(jù)酶的作用方式來分可以分為內(nèi)切型和外切型的酶[6-7]；根據(jù)氨基酸序列來分，褐藻膠裂解酶分屬到7個(gè)多糖裂解酶家族(polysaccharide lyase family)，即PL5、PL6、PL7、PL14、PL15、PL17，PL18；根據(jù)底物特異性來分，可分為polyM特異性裂解酶、polyG特異性裂解酶和可降解polyM和polyG的雙功能裂解酶[5]。從結(jié)構(gòu)上來看，褐藻膠裂解酶主要可以分為3類：①β果凍卷，PL7、PL14，PL18家族的酶多為這種結(jié)構(gòu)；②(α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)，PL5、PL15、PL17家族的酶多為這種結(jié)構(gòu)；③β螺旋，PL6家族的酶多為這種結(jié)構(gòu)[8]。

褐藻膠裂解酶通過β消除的方式降解褐藻膠，其具體的催化機(jī)制可以分為組氨酸(Tyr)/Tyrβ消除、金屬離子輔助β消除。本文中，筆者主要綜述目前褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)分類以及催化機(jī)制的研究進(jìn)展。

1 褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)

1.1 β果凍卷(β jelly roll)

β果凍卷結(jié)構(gòu)中主要含有兩條反向平行的β折疊片，如圖1所示，內(nèi)凹片段SA(Sheet A)和外凹片段SB(Sheet B)，這兩條β折疊片從中間彎曲近90度并且由多條環(huán)所連接，從而使得整個(gè)結(jié)構(gòu)呈球形。SA片段形成的裂縫中含催化活性位點(diǎn)，褐藻膠通過裂縫進(jìn)入其中，與活性位點(diǎn)的氨基酸殘基相互作用，由此可推斷SA片段中保守的氨基酸殘基對(duì)這一類酶的催化機(jī)制有著十分重要的影響。β果凍卷是褐藻膠裂解酶中最常見的折疊方式。目前，在已經(jīng)解析晶體結(jié)構(gòu)的褐藻膠裂解酶中，有13種褐藻膠裂解酶采用β果凍卷折疊，其中有9種來自PL7家族，2種來自PL14家族，2種來自PL18家族，如表1所示。

圖1 具有β果凍卷結(jié)構(gòu)的褐藻膠裂解酶的三維結(jié)構(gòu)

PL7家族的褐藻膠裂解酶多采用β果凍卷的結(jié)構(gòu)(圖1(a))，目前已經(jīng)表征的10種褐藻膠裂解酶中有9種來自其中，包括由PseudomonasaeruginosaPAO1產(chǎn)生的PA1167[9]、Klebsiellapneumoniae產(chǎn)生的AlyA、Corynebacteriumsp.ALY-1產(chǎn)生的alyPG[10]、Zobelliagalactanivorans產(chǎn)生的AlyA1和AlyA5[11]，以及由Sphingomonassp.A1產(chǎn)生的A1-II[12]，還有來源于Persicobactersp.CCB-QB2的AlyQ[13]、來源于Flavobacteriumsp.UMI-01的FlAlyA[14]及來源于VibriosplendidusOU02的AlyB[15]。

PA1167(PDB:1VAV)是該家族最早被表征的采用β果凍卷結(jié)構(gòu)的酶，它由3條短的α螺旋和兩條反向平行的β折疊片構(gòu)成。它的SA片段由8條β鏈、SB片段由7條β鏈構(gòu)成。該家族的A1-II’(PDB:2CWS)是目前研究較為透徹的酶，它包含2個(gè)反向平行的β折疊片和4個(gè)小α螺旋結(jié)構(gòu)。其中9條β鏈組成SA，7條β鏈組成SB片段。該酶的活性中心由Arg146、Gln189、His191和Tyr2844個(gè)氨基酸殘基組成，作為一種內(nèi)切型的酶，該酶的活性中心呈敞開狀。通過結(jié)構(gòu)解析，多數(shù)催化位點(diǎn)均處于SA上(如SA3、SA4和SA5)，其中位于SA3上的Arg59、Glu61和Arg63，與位于SA5上的Gln102、His104以及SA4上的Tyr193、Lys195、Gly197、Tyr199和Gln201均處于酶分子的表面，構(gòu)成了一個(gè)活性裂隙，在催化反應(yīng)中起著重要的作用。同時(shí)，沿著折疊片結(jié)構(gòu)分布的一些高度保守的位點(diǎn)如Phe34、Ser60、Leu62、Phe194、Ala196和Leu218，這些處于催化活性中心周圍的氨基酸殘基與周圍的同源性殘基如Trp7、Ile11、Tyr29、Ile89、Ile103和Phe215共同圍成一個(gè)疏水性的區(qū)域，對(duì)于維持酶的穩(wěn)定性具有重要作用。對(duì)于SB來說，其具體作用尚未被闡明，推測(cè)其具有維持酶的剛性結(jié)構(gòu)等作用。

PL18家族的褐藻膠裂解酶相對(duì)于PL7家族的褐藻膠裂解酶來說，主要存在兩點(diǎn)差異：一方面，大多數(shù)PL18家族的褐藻膠裂解酶的編碼基因推測(cè)的序列中含有N端延伸，起到分子伴侶的作用，從而促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊。這段結(jié)構(gòu)在蛋白質(zhì)成熟之后，大多會(huì)被切除。另一方面，存在維持酶活的二價(jià)金屬離子Ca2+遠(yuǎn)離酶的活性中心，不直接參與催化反應(yīng)，但是對(duì)于維持酶活來說至關(guān)重要。2種晶體結(jié)構(gòu)已經(jīng)解析的的PL18家族的酶Aly272、Aly-SJ02均來自Pseudoalteromonas(圖1(b))；成熟的Aly-SJ02酶表現(xiàn)出典型的β果凍卷結(jié)構(gòu)，類似于PL7中內(nèi)切式褐藻膠裂解酶的活性位點(diǎn)結(jié)構(gòu)，Aly-SJ02中含有3條相鄰的β鏈，SA2、SA3、SA4形成兩段敞開的催化溝槽[16]。

PL14家族是所有家族中唯一的一個(gè)既包含細(xì)菌來源又包含病毒和真菌來源的褐藻膠裂解酶。2種已經(jīng)被表征的14家族褐藻膠裂解酶，是由小球藻病毒產(chǎn)生的vAL-1[17]和Aplysiakurodai產(chǎn)生的AkAly30[18]。vAL-1由N-末端細(xì)胞附著結(jié)構(gòu)域和C末端催化結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，目前僅解析了VAL-1的C端結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域采取了β果凍卷的結(jié)構(gòu)，對(duì)VAL-1進(jìn)行截短，發(fā)現(xiàn)在pH 7.0的條件下產(chǎn)生二到六糖，在pH 10.0條件下優(yōu)先產(chǎn)生二糖，這表明催化位點(diǎn)表面的電荷改變會(huì)影響底物的結(jié)合方式并且調(diào)節(jié)酶的內(nèi)切、外切作用(圖1(c))。

1.2 (α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)(α/α barrel)

(α/α)桶狀結(jié)構(gòu)由3到7個(gè)反向平行的α螺旋構(gòu)成，目前有4種采取(α/α)桶狀結(jié)構(gòu)的褐藻膠裂解酶被表征(圖2)，其中有2種來自PL5家族，1種來自PL15家族，1種來自PL17家族(表2)。從結(jié)構(gòu)上來看，PL5家族的褐藻膠裂解酶，是僅含有催化結(jié)構(gòu)域的單結(jié)構(gòu)域蛋白，而PL15、PL17家族的褐藻膠裂解酶，除了催化結(jié)構(gòu)域外還有其他結(jié)構(gòu)域，因此他們屬于多結(jié)構(gòu)域蛋白，采用這種結(jié)構(gòu)酶的催化中心由兩層α螺旋組成，從而形成深隧道狀結(jié)構(gòu)，以容納底物。

表2 具有桶狀結(jié)構(gòu)的褐藻膠裂解酶的特征

2種被表征的PL5家族的褐藻膠裂解酶，Sphingomonassp.產(chǎn)生的A1-III[19]和PseudomonasaeruginosaPAO1產(chǎn)生的PA3547[20]均是內(nèi)切型并且是polyM特異性的褐藻膠裂解酶。A1-III由12個(gè)α螺旋構(gòu)成，其中有6個(gè)內(nèi)螺旋和5個(gè)外螺旋，形成有4個(gè)重復(fù)發(fā)卡結(jié)構(gòu)的(α6/α5)桶狀結(jié)構(gòu)。褐藻膠進(jìn)入隧道狀裂縫，被α內(nèi)螺旋所包圍，從而與催化位點(diǎn)的殘基相互作用。PA3547與A1-III相比來看，主要的差異存在于N端和C端結(jié)構(gòu)域(圖2(a))。

Agrobacteriumtumefaciens產(chǎn)生的Atu3025是唯一一個(gè)被表征的PL15家族的褐藻膠裂解酶(圖2(b))。它是一種外切型的酶，它由N端小β折疊結(jié)構(gòu)域、(α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)域以及C端反相平行β折疊結(jié)構(gòu)域共同組成。其中N端小β折疊結(jié)構(gòu)域的功能尚未被表征，(α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)域由15個(gè)α螺旋組成，其中有6個(gè)內(nèi)螺旋，6個(gè)外螺旋組成桶狀催化結(jié)構(gòu)域，C端的β折疊結(jié)構(gòu)域由18條β鏈組成，從而形成三層反向平行的β折疊三明治結(jié)構(gòu)。與PL5家族的褐藻膠裂解酶相比較，Atu3025的活性位點(diǎn)位于(α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)域和C端的β折疊結(jié)構(gòu)域，底物跨越兩個(gè)結(jié)構(gòu)域與酶的活性位點(diǎn)相互作用[21]。

Saccharophagusdegradans2-40產(chǎn)生的Alg17c是唯一被表征的PL17家族褐藻膠裂解酶，Alg17c是一種外切型的褐藻膠裂解酶(圖2(c))，與PL15家族Atu3025不同的是，Alg17c僅由(α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)域和C端反向平行的β折疊結(jié)構(gòu)域組成同源二聚體，但是缺少N端的小β折疊。Alg17c的桶狀區(qū)域由13個(gè)螺旋組成，其中12個(gè)形成(α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)和1個(gè)額外的螺旋，額外的螺旋支撐在桶管的側(cè)面，保持其剛性。C端結(jié)構(gòu)域展示出三層反向平行β折疊結(jié)構(gòu)，頂層附近有4個(gè)小螺旋，插入2個(gè)結(jié)構(gòu)域之間。底物也結(jié)合在(α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)域和C端β折疊結(jié)構(gòu)域中[22]。

圖2 具有α螺旋結(jié)構(gòu)的褐藻膠裂解酶的三維結(jié)構(gòu)

1.3 β螺旋結(jié)構(gòu)(β-helix)

PL6家族的AlyGC是唯一的一個(gè)采用右手β螺旋的褐藻膠裂解酶(圖3)，它是一種外切性polyG特異性的褐藻膠裂解酶[23]。該酶由N端和C端2個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，并且這2個(gè)結(jié)構(gòu)域都采用β螺旋結(jié)構(gòu)，β螺旋的結(jié)構(gòu)由三段β折疊片組成-PB1、PB2、PB3。2個(gè)折疊之間的轉(zhuǎn)角或者環(huán)被稱為T、T1(存在于PB1和PB2之間)、T2(存在于PB2和PB3之間)和T3(存在于PB3和PB1之間)。β螺旋一圈的排列是PB1-T1-PB2-T2-PB3-T3，PB1和PB2幾乎是反平行的，PB3幾乎垂直于PB2。AlyGC的N末端結(jié)構(gòu)域由12個(gè)PB1鏈、14個(gè)PB2鏈和14個(gè)PB3鏈組成。C末端結(jié)構(gòu)域由9個(gè)PB1鏈、11個(gè)PB2鏈和9個(gè)PB3鏈組成。AlyGC的活性位點(diǎn)位于N端結(jié)構(gòu)域，但C端結(jié)構(gòu)域?qū)τ诰S持酶AlyGC的活性來說也是必不可少的。該酶的活性中心是位于N端結(jié)構(gòu)域表面的長(zhǎng)裂縫，周圍環(huán)繞著來自N端結(jié)構(gòu)域的β鏈和來自C端結(jié)構(gòu)域的一個(gè)環(huán)，該酶活性中心的一端被阻斷，導(dǎo)致酶外切作用模式。

圖3 具有β螺旋結(jié)構(gòu)的褐藻膠裂解酶(PL6家族)的三維結(jié)構(gòu)

2 褐藻膠裂解酶的催化機(jī)制

褐藻膠裂解酶通過β消除的方式降解褐藻膠，β消除降解褐藻膠分三步進(jìn)行：①去除羧基陰離子上的負(fù)電荷，然后通過鹽橋(組氨酸或賴氨酸)中和電荷；②需要酶活性中心的一個(gè)殘基作為廣義堿，將褐藻膠C5位的質(zhì)子抽走，酶活性中心的另一個(gè)殘基作為廣義酸提供質(zhì)子；③來自羧基的電子轉(zhuǎn)移在C4、C5之間形成雙鍵，從而導(dǎo)致含氧糖苷鍵的斷裂[24]。根據(jù)去除C5羧基上負(fù)電荷的機(jī)制以及廣義酸堿催化時(shí)廣義酸和廣義堿的不同，β消除可分為：組氨酸(Tyr)/Tyrβ消除，金屬離子輔助β消除。大部分褐藻膠裂解酶采用His(Tyr)/Tyr 型β消除，采用這種方式進(jìn)行β消除的酶，大多數(shù)由酶中的Glu、His、Arg或者Asn殘基來消除羧基陰離子上的負(fù)電荷。在這種類型的β消除中，Tyr作為廣義酸，提供質(zhì)子。根據(jù)廣義堿的不同，這種類型的β消除又可以進(jìn)一步進(jìn)行分類，若廣義堿還為原來的Tyr，則這類消除可定義為Tyr/Tyr型β消除；若廣義堿為His或者另一個(gè)Tyr，則可以將這類消除方式定義為 His(Tyr’)/Tyr型β消除。

2.1 Tyr/Tyrβ消除機(jī)制

PL5家族中的A1-III采用這種β消除機(jī)制(圖4(a))，基于A1-III與三糖降解產(chǎn)物復(fù)合結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)出Tyr246在酶催化過程中既作為廣義酸又作為廣義堿。在催化過程中C5端羧基的負(fù)電荷首先被Arg239和Asn191所中和，因此C5中的質(zhì)子相對(duì)容易被移除，形成一個(gè)羧酸鹽二價(jià)陰離子中間體，緊接著Tyr246作為廣義堿從甘露糖醛酸C5中提取質(zhì)子，然后Tyr246又作為廣義酸向糖苷鍵提供質(zhì)子，從而在C4和C5之間形成雙鍵，進(jìn)而導(dǎo)致糖苷鍵的斷裂[19]。PL18家族的 aly-SJ02也采用這種催化機(jī)制，在 aly-SJ02中，Tyr353殘基在催化過程中既作為廣義酸又作為廣義堿，aly-SJ02活性中心的保守殘基包括Arg219、Lys223、Gln257、His259、Tyr347以及 Lys349，這些保守位點(diǎn)的殘基起到識(shí)別并且結(jié)合褐藻膠羧基的作用[16]。

2.2 His(Tyr’)/Tyrβ消除機(jī)制

His(Tyr’)/Tyr 型β消除機(jī)制既適用于順式消除又適用于反式消除，順式消除和反式消除的選取取決于酶+1位點(diǎn)結(jié)合的底物殘基，因此對(duì)于雙功能的酶來說，它既可以采取順式消除又可以采取反式消除。對(duì)于特異性降解G片段的酶來說，它們只能采取反式消除，而特異性降解M的酶只能采取順式消除。在這種消除機(jī)制中，Glx(Glu和Gln)和Asx(Asp和Asn)殘基通常作為中和劑，來中和+1位點(diǎn)處結(jié)合糖醛酸羧基端的負(fù)電，一些帶正電荷的氨基酸殘基如His和Arg通過與底物形成氫鍵來輔助中和負(fù)電。在這一類消除機(jī)制中，Tyr殘基通常作為廣義酸提供質(zhì)子。對(duì)于采取順式消除的酶來說，通常采用相同的Tyr作為廣義堿來接受質(zhì)子；而對(duì)于采取反式消除的酶來說，通常采用His殘基來接受質(zhì)子。

A1-II’是PL7家族中首先被闡述催化機(jī)制的一種酶，通過對(duì)該酶與褐藻酸鹽四糖(GGMG)復(fù)合物的分析，在催化過程中A1-II’中的Gln189充當(dāng)中和劑，用來去除C5端羧基的負(fù)電荷，His191在催化過程中充當(dāng)廣義堿，Tyr284在催化過程中充當(dāng)廣義酸[25]。PL15家族催化機(jī)制唯一被表征的酶是Atu3025，這是一種內(nèi)切型以及雙功能的酶，通過分析該酶的突變體和褐藻酸三糖(ΔGGG)的復(fù)合物可以得出：Atu3025中帶正電荷的氨基酸殘基 Arg199、Arg314和His531在催化過程中起到穩(wěn)定以及中和C5羧基負(fù)電荷的作用，該酶的His311殘基在催化過程中充當(dāng)廣義堿，接受質(zhì)子，而Tyr365殘基在催化過程中充當(dāng)廣義酸，提供質(zhì)子[21]。

PL17家族的Alg17c采用Tyr’/Tyr 型β消除(圖4(b))，這種消除機(jī)制與His/Tyr型β消除有細(xì)微的差別，通過分析突變菌株與ΔMMG復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，可以得出該酶的Tyr450殘基作為廣義堿從C5中抽取一個(gè)質(zhì)子，Tyr258殘基作為廣義酸在催化過程中起到提供質(zhì)子的作用。該酶中的Asn201和His202 兩個(gè)殘基在催化過程中起到穩(wěn)定以及中和羧基端負(fù)電荷的作用[22]。

關(guān)于PL14家族褐藻膠裂解酶催化機(jī)制報(bào)道較少。小球藻病毒產(chǎn)的酶vAL-1的催化過程對(duì)pH值有較大的依賴性，通過對(duì)結(jié)構(gòu)和突變分析，Lys197殘基對(duì)酶在pH7.0條件下維持活性起到重要的作用，Ser219殘基在pH10.0條件下對(duì)維持該酶活性至關(guān)重要[17]。對(duì)于polyM特異性真核酶AkAly30，其與底物結(jié)合模型顯示Lys99殘基在+1位點(diǎn)處與polyM殘基形成離子鍵，Tyr140和Tyr142殘基偶聯(lián)在一起并與糖苷鍵形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)。由此可以看出這2種PL14家族酶的催化機(jī)制有著很大的不同[18]。

2.3 金屬離子輔助型β消除機(jī)制

PL6家族所有已經(jīng)表征了的酶均采用Ca2+輔助β消除的機(jī)制來降解褐藻膠(圖4(c))，通過對(duì)酶AlyGC的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，可發(fā)現(xiàn)Ca2+與Asn181、Glu213、Glu215和Glu184殘基共同位于酶的活性中心，在催化過程中的作用類似于His(Tyr’)/Tyr型β消除中Glx和Asx的作用，中和+1位點(diǎn)處所結(jié)合糖醛酸羧基的負(fù)電。在這種類型的β消除中，Lys220充當(dāng)廣義堿，Arg241充當(dāng)廣義酸[23]。

圖4 不同類型的褐藻膠裂解酶的反應(yīng)機(jī)制

3 結(jié)論

褐藻膠裂解酶是多糖裂解酶家族中的一種酶，按照褐藻膠裂解酶的序列來看，目前已經(jīng)表征的褐藻膠裂解酶可分屬到7個(gè)多糖裂解酶家族。本文中，筆者介紹了目前已經(jīng)表征的酶的結(jié)構(gòu)，褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)大致可以分為三類：β果凍卷、(α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)以及β螺旋結(jié)構(gòu)。采用β果凍卷結(jié)構(gòu)的酶主要是由2個(gè)β折疊片和少量的α螺旋組成的球狀結(jié)構(gòu)，PL7、PL14、PL18家族的褐藻膠裂解酶多采取這類的結(jié)構(gòu)。(α/α)n桶狀結(jié)構(gòu)通常由3到7個(gè)α螺旋組成，PL5、PL15、PL17家族的褐藻膠裂解酶大多采取這種結(jié)構(gòu)。β螺旋結(jié)構(gòu)由三段β折疊片以及轉(zhuǎn)角和環(huán)組成，PL6家族的褐藻膠裂解酶多采取這種結(jié)構(gòu)。

褐藻膠裂解酶通過β消除來降解褐藻膠，根據(jù)催化過程中有無金屬離子輔助，β消除可進(jìn)一步分為His(Tyr)/Tyrβ消除和金屬離子輔助型β消除，在His(Tyr’)/Tyrβ消除中，根據(jù)+1位點(diǎn)處結(jié)合底物殘基的不同，β消除又可分為順式消除和反式消除。盡管對(duì)部分褐藻膠裂解酶的結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制有了很深入的研究，仍然有大部分的酶尚未表征，需要進(jìn)一步去研究。