克隆性造血對腫瘤體細(xì)胞突變檢測的影響

陳馨寧，王蓓麗,2，郭 瑋,2

1.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200032；2.復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院檢驗(yàn)科，福建 廈門 361015

克隆性造血（clonal hematopoiesis，CH）是一種與年齡相關(guān)的生物學(xué)狀態(tài)［1］。隨著對這一問題探索的深入，研究人員逐漸摸索出CH的大致突變譜，對其發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制也有了初步了解。相關(guān)研究［1］也揭示了CH與惡性血液腫瘤及非惡性疾病間的關(guān)聯(lián)性。在近5年內(nèi)，CH的文獻(xiàn)報(bào)道爆炸式增長，越來越多的研究者開始著眼于其對腫瘤體細(xì)胞突變的影響。

腫瘤的診療已經(jīng)逐漸步入精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代，醫(yī)患雙方在追求個(gè)體化的同時(shí)也更加強(qiáng)調(diào)精確性。CH對基因檢測會帶來怎樣的影響？是否會對后續(xù)臨床應(yīng)用產(chǎn)生干擾？醫(yī)師和患者在報(bào)告解讀時(shí)有哪些需要額外關(guān)注的地方？以上都是業(yè)界關(guān)注的熱點(diǎn)，本文也將就此展開討論。

1 CH的定義

CH通常是指具有單或多個(gè)體細(xì)胞突變的血細(xì)胞克隆亞群的增殖，伴或不伴輕度血細(xì)胞減少［1］。2015年提出了意義未明的CH（CH of indeterminate potential，CHIP）這一術(shù)語用于描述血液腫瘤前狀態(tài)，指不符合惡性血液疾病的個(gè)體，血液或骨髓中出現(xiàn)相關(guān)體細(xì)胞突變的現(xiàn)象，亦被稱為與年齡相關(guān)的CH（agerelated CH，ARCH）［2-3］。在血液相關(guān)文獻(xiàn)表述中，CHIP這一表達(dá)更為常用，而其余如實(shí)體瘤或非惡性疾病相關(guān)文獻(xiàn)中則更傾向于使用CH。為了便于臨床應(yīng)用和基因檢測結(jié)果解讀，CH需要在定義上與體細(xì)胞突變進(jìn)行明確的區(qū)分（表1）［4］。

表1 CH與體細(xì)胞突變的比較Tab.1 Comparison between CH and somatic mutation

2 CH相關(guān)因素

CH的發(fā)生是造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）內(nèi)在衰老和外在環(huán)境因素共同作用的必然結(jié)果和客觀存在［5］。

2.1 年齡

普遍認(rèn)為，CH與年齡相關(guān)，但并非必然結(jié)局。2012年，相關(guān)研究［6］報(bào)道并首次證明了體細(xì)胞突變基因TET2的CH發(fā)生在健康老年個(gè)體身上。CH的發(fā)生率和突變數(shù)隨著年齡的增長而增長，且在老年個(gè)體中（＞60歲）發(fā)生率達(dá)到5.7%～20.0%［1，7-8］。因此，盡管CH與特定癌種并沒有直接關(guān)系，但生殖系統(tǒng)腫瘤由于其發(fā)病年齡普遍較低，CH發(fā)生率也最低［9］。

2.2 性別

在60歲及60歲以上人群中，有研究［1］發(fā)現(xiàn)，男性相較于女性，突變檢出率更高。這與男性患骨髓增生異常綜合征和急性髓系白血病的風(fēng)險(xiǎn)更高一致。

2.3 吸煙史

CH在有吸煙史的個(gè)體中也更常見。吸煙史甚至?xí)绊慍H突變的類型［9］。

2.4 人種

根據(jù)報(bào)道，西班牙裔人群中CH相對較低，這與他們除急性早幼粒細(xì)胞白血病外其他髓系腫瘤的發(fā)病率低相一致［1］。

2.5 治療

接受放療的患者CH的發(fā)生率較高，甲狀腺癌患者由于放射性碘治療的原因，CH的發(fā)生率在所有非血液系統(tǒng)腫瘤中最高?；煂τ贑H的影響存在爭議，部分認(rèn)為存在一定促進(jìn)克隆擴(kuò)增的作用。在異體HSC移植中，如果供體存在CHIP，可能導(dǎo)致移植后受體體內(nèi)發(fā)生克隆增長，盡管不會加速惡化血液疾病本身，但仍可能帶來如感染、移植物抗宿主病等風(fēng)險(xiǎn)［10］。

3 CH的意義

常見CH基因通常與血液惡性腫瘤相關(guān)，如DNMT3A、TET2、PPM1D、ASXL1、ATM和TP53依次是發(fā)生頻率較高的CH突變，占到了所有CH突變的60%［11］。CH的基因突變譜尚不明確，研究［12］中所報(bào)道過的與CH相關(guān)的基因包括DNMT3A、TET2、ASXL1、TP53、JAK2、SF3B1、GNB1、CBL、SRSF2、GNAS、PPM1D、CUX1、KMT2D、BCOR、SETDB1、CREBBP、PIGA、SETD2、BCORL1、U2AF1、ZRSR2、LUC7L2、EZH2、RUNX1、MPL、RAD21、STAG2、SMC3、SMC1A、CTCF、FLT3、ATM、GATA2、WT1、ETV6、IDH1、IDH2、PHF6、NRAS、KRAS、PTPN11、SH2B3、STAT3、MYD88、CALR、CEBPA、KIT、NPM1、NF1和FAT1。

目前，傾向于將CH界定為一種生理性突變。但越來越多的研究表明，CH將是未來疾病風(fēng)險(xiǎn)的一種重要生物標(biāo)志物。Coombs等［9］發(fā)現(xiàn)，CH，尤其是攜帶白血病相關(guān)驅(qū)動突變（CHPD）與腫瘤的較差生存質(zhì)量相關(guān)，且后續(xù)可能繼發(fā)治療相關(guān)的髓系腫瘤包括骨髓增殖性腫瘤和急性白血病。同時(shí)，也與較短的生存時(shí)間相關(guān)，患者大多死于原發(fā)腫瘤的進(jìn)展［5，13］。CH可以作為較差臨床轉(zhuǎn)歸的間接衡量指標(biāo)。CH與癌癥進(jìn)展之間的關(guān)聯(lián)有可能是由于CH克隆與癌癥細(xì)胞間的相互作用［9］，也可能是由于CH對免疫監(jiān)控產(chǎn)生的影響［14］。目前仍缺乏對患者的大樣本長期隨訪來明確描述CH實(shí)體腫瘤患者的不良事件譜及其機(jī)制。因此，目前也無法建立有效的干預(yù)手段［15］。

4 CH的檢測和挑戰(zhàn)

隨著測序技術(shù)的普及，基因檢測在腫瘤中廣泛使用。醫(yī)師和患者可能在無意間接受CH相關(guān)檢測結(jié)果。基因檢測對CH鑒定，通常需要腫瘤來源DNA，如腫瘤組織或循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）和配對基因組DNA，如外周血或白細(xì)胞等。其次，測序技術(shù)的選擇對CH檢出率至關(guān)重要，檢出率在很大程度上受到樣本種類、最低檢出限、測序深度、靈敏度及生物信息學(xué)分析的影響（表2）。

表2 檢測CH的方法比較Tab.2 Comparison among CH detecting methods

4.1 組織樣本

與先前將CH研究重點(diǎn)放在血液系統(tǒng)疾病中不同，2017年，Coombs等［9］首次將這一概念推廣至非血液系統(tǒng)領(lǐng)域。造血細(xì)胞滲透于所有的組織，在腫瘤組織中也不例外。因此，在腫瘤微環(huán)境中可以檢測到CH相關(guān)突變。該研究［9］檢測了8 810例患者的配對腫瘤組織和血樣，并得出如下結(jié)論：相關(guān)CH突變的等位基因的突變豐度（variant allele fraction，VAF）與腫瘤純度成反比；血液中CH突變中位VAF是4.4%，而腫瘤組織中CH突變中位VAF是0.5%，且23%的CH突變在組織中無法檢出，可能是腫瘤組織中血細(xì)胞的浸潤所致。。

值得注意是，組織中對CH界定的方法通常為雙層過濾模式：當(dāng)血液VAF是腫瘤組織VAF的2倍以上，在剔除假陽性及胚系突變后，將突變分為白血病淋巴瘤相關(guān)基因及無關(guān)基因。根據(jù)自定義的讀長等生物信息學(xué)條件作為閾值，隨后再根據(jù)VAF層層界定［9，14，18-19］。

4.2 ctDNA樣本

在基因診斷行業(yè)，液體活檢早已不陌生，它是一種將人體體液作為樣本來源檢測獲取疾病信息的技術(shù)［20］。液體活檢的發(fā)展適時(shí)地與“精準(zhǔn)醫(yī)療”概念的推廣相契合。ctDNA憑借其在腫瘤全病程（早診早篩、耐藥監(jiān)測、伴隨診斷等）中的應(yīng)用成為強(qiáng)有力的生物標(biāo)志物，已經(jīng)開始從科研走向臨床。對許多癌種，如非小細(xì)胞肺癌、結(jié)直腸癌等帶來理解上的顛覆。

許多研究也就CH突變之于ctDNA檢測的影響進(jìn)行了一系列數(shù)據(jù)積累和分析（表3）。綜合表中羅列的研究，不難發(fā)現(xiàn)，CH相關(guān)研究對測序深度有一定的要求。

ctDNA中對于CH的界定，除了上述同組織一樣應(yīng)用過濾條件外，Hu等［22］通過流式細(xì)胞分選技術(shù)，同時(shí)引入數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)（digital droplet polymerase chain reaction，ddPCR）技術(shù)，對測序結(jié)果進(jìn)行單位點(diǎn)驗(yàn)證，明確其中KRAS突變患者的突變來源。在且僅在淋巴細(xì)胞及其四個(gè)亞群中只檢測到KRAS突變，表明一個(gè)淋巴細(xì)胞獲得該突變后經(jīng)歷克隆增殖，這與CH情況一致。

4.3 CH對基因檢測提出的挑戰(zhàn)

2019年，Razavi等［25］提出通過超高深度ctDNA測序分析發(fā)現(xiàn)，93.6%的無癌志愿者的白細(xì)胞攜帶一個(gè)CH突變，而這一比例在癌癥患者群體中竟高達(dá)99.1%。這一結(jié)論一時(shí)在業(yè)界激起千層浪，人們無外乎質(zhì)疑起ctDNA的臨床應(yīng)用場景。

表3 二代測序檢測ctDNA在實(shí)體瘤中CH的研究Tab.3 CH related research on next-generation sequencing of ctDNA in patients with solid tumor

4.3.1 靶向藥物治療位點(diǎn)

以液體活檢發(fā)展較為成熟的肺癌為例，在最新版非小細(xì)胞肺癌美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）指南（2020.1版）中列出其基因檢測相關(guān)靶點(diǎn)：傳統(tǒng)靶點(diǎn)包括EGFR、ALK、ROS1、BRAF、KRAS、NTRK、PD-L1；新靶點(diǎn)包括MET、RET、HER2、TMB?？梢园l(fā)現(xiàn)，CH涉及到的基因基本與靶向治療位點(diǎn)無關(guān)。其他癌種相關(guān)靶點(diǎn)如胃癌的HER2、NTRK，卵巢癌的BRCA1/2、NTRK等，由此可見，對于實(shí)體瘤患者來說，CH的發(fā)生對靶向藥物的使用影響較小。

4.3.2 血液腫瘤突變負(fù)荷（blood tumor mutation burden，bTMB）

TMB是免疫治療領(lǐng)域中重要的生物標(biāo)志物之一。ctDNA具有無創(chuàng)、動態(tài)監(jiān)測的優(yōu)勢，但是由于腫瘤異質(zhì)性、檢測平臺敏感性及欠規(guī)范化，對于ctDNA檢測TMB本身還需更多大樣本、前瞻性的臨床研究進(jìn)行探索。撇去以上因素，CH現(xiàn)象對于腫瘤患者bTMB結(jié)果的影響，可以通過配對白細(xì)胞同等深度測序的過濾及優(yōu)化算法等技術(shù)規(guī)避［23］。

4.3.3 微小殘留病變（minimal residual disease，MRD）監(jiān)測

盡管目前掌握患者CH狀態(tài)后并沒有明確的臨床干預(yù)措施。ctDNA對于術(shù)后患者具有潛在的意義［26］，目前認(rèn)為術(shù)后微小殘留病變監(jiān)測涉及高深度測序的手段，大多需要納入手術(shù)組織作為基線狀態(tài)以去除CH的影響。

因此CH的檢出對于基因檢測的臨床發(fā)展并非一種阻礙。通過過濾方法、篩選條件和流程優(yōu)化可以明確結(jié)果中CH的存在，并提出其可能對相應(yīng)臨床應(yīng)用場景產(chǎn)生的干擾。CH的存在使精準(zhǔn)醫(yī)療更加精準(zhǔn)化、規(guī)范化。

5 結(jié)語與展望

在血液腫瘤和心血管等非惡性疾病與CH的認(rèn)知基礎(chǔ)上，研究已經(jīng)開始著眼于CH現(xiàn)象對于實(shí)體腫瘤的重要臨床意義。本綜述也明確了基因檢測，無論是組織樣本還是ctDNA樣本，若想在實(shí)體腫瘤的全病程中得到長足的發(fā)展，CH對腫瘤體細(xì)胞檢測所產(chǎn)生的影響必定是要解決的問題之一。盡管在技術(shù)和生物信息學(xué)層面可以識別鑒定CH突變的存在以及在報(bào)告中對CH突變進(jìn)行剔除，但仍亟待行業(yè)規(guī)范的制定。